生物化学与分子生物学DNA的生物合成

《生物化学与分子生物学DNA的生物合成》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学与分子生物学DNA的生物合成（110页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、生物化学与分子生物学,第十四章,DNA的生物合成 DNA Biosynthesis ( Replication ),复制(replication) 是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。,本章主要内容：,DNA复制的基本特征 DNA复制的酶学和拓扑学变化 原核生物DNA复制过程 真核生物DNA生物合成过程 逆转录和其他复制方式,DNA复制的基本特征 Basic Rules of DNA Replication,第 一 节,半保留复制(semi-conservative repli

2、cation) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication),DNA复制的主要特征,一、 DNA以半保留方式进行复制,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念:,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验:,实验结果支持半保留复

3、制的设想。,含15N-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义:,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C

4、 T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制。,二、DNA复制从起点向两个方向延伸,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之

5、间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,三、DNA复制反应呈半不连续特征,领头链 (leading strand),后随链 (lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leading strand) 。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链(lagging strand) 。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,DNA复制的酶学和拓扑学变化,第 二 节,The

6、Enzymology and Topology of DNA Replication,参与DNA复制的物质:,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol； 模板(template): 解开成单链的DNA母链； 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合； 其他的酶和蛋白质因子。,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,RNA引物,RNA引物,子代DNA,聚合反应的特点:,DNA 新链生成需RNA引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进

7、行。,一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：,1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性,3 5外切酶活性:,5 3外切酶活性:,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性:,（一）原核生物有3种DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol ,原核生物的DNA聚合酶,个核心酶 1个-复合物（、 6种亚基） 1对-亚基（可滑动的DNA夹子）,DNA聚合酶全酶结构,全酶结构包括：,亚基（130 000）主要功能是合成DN

8、A 亚基具有35外切酶活性（复制保真性所必需）亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用,核心酶由、和亚基组成：,两侧的亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用,2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。,功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用,-复合物由6种亚基组成：、,功能：,DNA-pol （109kD）,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶

9、活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。,（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-po

10、l ,DNA-pol ,真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较,真核生物的DNA聚合酶,二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制的保真性,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。,此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。,遵守严格的碱基配对规律； 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 复制出错时有即时校对功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：,（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择,利用“错配”实验发现，DNA pol 对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能。 DNA pol 对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，因此实现其选择功能。,（二）聚合酶中的核酸外

11、切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。,DNA pol 的校读功能,三、复制中的解链伴有DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,E. Coli 基因图,解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 引物酶(primase

12、) 复制起始时催化生成RNA引物的酶。 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态,复制过程正超螺旋的形成：,解链过程中正超螺旋的形成,既能水解 、又能连接磷酸二酯键。,拓扑异构酶 拓扑异构酶,拓扑异构酶分类：,拓扑异构酶作用特点：,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端，

13、DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制：,拓扑酶的作用方式：,四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶的作用：,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。,功能：,DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较,原核生物DNA复制过程 The Process

14、of DNA Replication in Prokaryotes,第 三 节,起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物。,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,一、复制的起始,E.coli复制起始点 oriC,（一） DNA的解链,原核生物的复制起始部位及解链,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,（二）引物合成和引发体形成,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,

15、3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,引发体和复制叉的生成,二、DNA链的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成：,领头链的子链沿着53方向可以连续地延长。,后随链的合成,在复制叉同时合成前导链和后随链,复制过程简图,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,三、复制的终止,子链中的RNA引物被取代,真核生物DNA生物合成过程 The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes,第 四 节,真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等； DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换； 切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等。,真核生物与原核生物DNA复制的差异：,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组