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1、实验五 食品中产毒霉菌的分离与鉴定,二、实验原理,三、实验器材,一、实验目的,四、实验步骤,五、实验结果,一、实验目的,1 、学习并掌握食品中常见产毒霉菌分离纯化的主要方法和技术;进一步熟练掌握食品检样的处理及梯度稀释技术； 2 、掌握产毒霉菌的形态学鉴定技术，了解菌丝形态及其产孢结构在霉菌分类鉴定中的重要性；,二、实验原理,产毒霉菌极易在含糖的饼干、面包、粮食等类食品上生长，与食品卫生关系密切的霉菌大部分属于半知菌亚门中的曲霉属、青霉属和镰刀菌属。其产生的毒素主要有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉素、烟曲霉毒素、单端孢霉烯化合物、玉米赤霉烯酮、伏马菌素以及展青霉素、桔青霉素、黄绿青霉素等。,
2、霉菌产毒需要一定的条件，影响霉菌产毒的条件主要是食品基质中的水分、环境中的温度和湿度及空气的流通情况 。,曲霉属：黄曲霉、赭曲霉、杂色曲霉、烟曲霉、构巢曲霉和寄生曲霉等； 青霉属：岛青霉、桔青霉、黄绿青霉、扩张青霉、圆弧青霉、皱折青霉和荨麻青霉等； 镰刀菌属：犁孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、三线镰刀菌、雪腐镰刀菌、粉红镰刀菌、禾谷镰刀菌等； 其它菌属 ：有绿色木霉、漆斑菌属、黑色葡萄状穗霉等。,本属的产毒霉菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、杂色曲霉、 构巢曲霉和棕曲霉。这些霉菌的代谢产物为黄曲霉毒素、杂色曲霉素和棕曲霉毒素。 1、营养菌丝体 由具横隔的分枝菌丝构成；无色或有明亮的颜色,一部分埋伏型,一部分
3、气生型。,曲霉属,2、产孢结构 分生孢子梗大都无横隔,光滑、粗糙或有麻点。梗的顶端膨大形成棍棒形、椭圆形、半球形或球形的顶囊,在顶囊上生出一层或二层小梗,双层时下面一层为梗基, 每个梗基上再着生两个或几个小梗。从每个小梗的顶端相继生出一串分生孢子； 由顶囊、 小梗以及分生孢子链构成一个头状体的结构,称为分生孢子头。分生孢子头有各种不同颜色和形状 ,如球形、放射形、棍棒形或直柱形等。,曲霉属,黄曲霉,构巢曲霉,黄曲霉,黄曲霉,黑曲霉,烟曲霉,青霉属 本属产毒霉菌,主要包括黄绿青霉、桔青霉、圆弧青霉、展开青霉、纯绿青霉、红青霉、产紫青霉、冰岛青霉和皱褶青霉等。 这些霉菌的代谢产物为黄绿青霉素、桔青
4、霉素、圆弧偶氮酸、展青霉素、红青霉素、黄天精、 环氯素和皱褶青霉素。,1、营养菌丝体 呈无色、淡色或鲜明的颜色,具横隔, 或为埋伏型或部分埋伏型部分气生型 。气生菌丝密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。 2、产孢结构 分生孢子梗由埋伏型或气生型菌丝生出,稍垂直于该菌丝(除个别种外,不象曲霉那样生有足细胞),单独直立或作某种程度的集合及至密集为一定的菌丝束,具横隔, 光滑或粗糙。其先端生有扫帚状的分枝轮,称为帚状枝。帚状枝是由单轮或两次到多次分枝系统构成,对称或不对称,最后一级分枝即产生孢子的细胞,称为小梗。,青霉菌,镰刀菌属 本属的产毒霉菌主要包括禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、雪腐镰刀菌、 三线镰刀菌、
5、梨孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和木贼镰刀菌等。 这些霉菌的代谢产物为单端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮和丁烯酸内酯等。,1、营养菌丝体 气生菌丝发达高 0.51.0cm或较低为 0.30.5cm，或更低为0.10.2cm；稀疏的气生菌丝，甚至完全无气生菌丝而由基质菌丝直接生出黏孢层，内含大量的分生孢子。,2、产孢结构 可产生大、小两种分生孢子。 小型分生孢子通常假头状着生,较少为链状着生,或者假头状和链状着生兼有。 小型分生孢子生于分枝或不分枝的分生子梗 上,形状多样,卵形、梨形、椭圆形、长椭圆形、纺锤形、披针形、腊肠形、柱形、锥形、逗点形、圆形等。12(3)隔, 通常小型分生
6、孢子的量较大型分生孢子为多。 大型分生孢子产生在菌丝的短小爪状突起上或产生在分生孢子座上,或产生在粘孢团中;大型分生孢子形态多样,镰刀形、线形、纺锤形、披针形、柱形、腊肠形、蠕虫形、鳗鱼形,弯曲、直或近于直。顶端细胞多种形态,短啄形、锥形、钩形、线形、柱形,逐渐变窄细或突然收缩。,蓝色犁头霉,镰刀菌,链格孢霉菌,瓶霉菌,三、实验器材,样品：小麦、玉米、黄小米、面粉、米粉、面包、饼干、花生等 察氏培养基、高盐察氏培养基,PDA培养基,无菌生理盐水、乳酸石炭酸棉蓝染色液 培养皿、试管、锥形瓶、镊子、玻璃涂棒、显微镜、盖玻片、载玻片、解剖针、酒精灯、接种钩、接种针,四、实验步骤,（一）产毒霉菌的分离
7、,按GB/T4789.15-2003 方法进行分离,方法一 稀释平板法,1、检样的前处理及梯度稀释,25g检样,放入研钵磨碎 （可先加少量无菌生理盐水）,2、取10-1、10-2、10-3三个稀释度涂布平板，静置5min后倒置于温箱28-30培养3-5天。,方法二 点种法,1.采样 在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品250500g，尽快检验。 2.表面除菌 如为粮粒样品，取粮食样品1020g，放人灭菌的 150ml 三角瓶中，无菌加入无菌水超过样面12cm左右，塞好塞子充分振摇12min，将 水倒净后，将粮粒倒于无菌平皿中备用.,3.接种与培养 用无菌镊子将已处理好的粮粒胚部向下，均匀地插
8、种在高渗察氏平板或PDA培养基平板上(粮粒的一部分插入培养基中)，小粒样品如大米接种 10 粒皿，大 粒的样品(玉米、大豆等)接种5粒，每份样品共接种5个平板,将种有样品的平皿置2528孵箱培养57天，培养后期应每天观察菌落生长情况，以免生长较快的霉菌将其他的菌覆盖，影响观察及检验结果。,4、镜检与初分离 镜检 用接种钩在平皿上钩取一小块稍带少许培养基的培养物，放在已滴加 12 滴乳酸苯酚液的载玻片上，再用二支接种钩轻轻地将培养物分开， 然后盖上盖玻片， 先在低倍镜下找到培养物， 再将显微镜的聚光器位置降低，光圈调小，转至高倍镜下观察。,采用点植法 选择适合的琼脂平板，左手拿起平板底，使培养基
9、朝下，右手持接种针，蘸取少量孢子点种在培养基中心点或成三角形的三分点，然后盖上平皿盖，始终保持平板底朝上，放于孵箱中培养；这种方法可避免霉菌孢子散落在培养基上，使菌落生长一个或三个扇形的典型菌落，便于观察。,初分离 将它们分别转种于相应的察氏培养基或PDA培养基的平板，2528孵箱培养514天。,（二）产毒霉菌的鉴定,1、观察各产毒霉菌的菌落特征,(1)菌落生长的速度 用培养一定天数的菌落直径大小来表示霉菌生长的速度。,(2)菌落的颜色 霉菌菌落的颜色应包括菌落表面的颜色；菌落背面的颜色；菌落周围培养基的颜色(是否仅限于培养基覆盖的部分或扩散于更大范围)；以及霉菌在不同生长阶段的颜色变化(包括
10、表面和背面)。,(3)菌落的质地 由于菌丝的长短和疏密，以及孢子的有无和多少，菌落的质地可为绒状，絮状，绳状和束状。 (4)菌落的表面 疏松或致密；平坦、凹陷或隆起，有无皱褶，有无放射状或同心环状的沟纹，边缘是否整齐等。,(5)渗出物 有的菌种常常在菌落表面出现的带颜色的似液体物即为渗出物，记录其色调和分泌的量。 (6)其他 是否出现除霉味以外的其他特殊的气味。,2、观察各产毒霉菌的镜下特征 将生长茂盛的菌丝用乳酸石炭酸棉蓝染液做压滴标本镜检以鉴定到属或种。 主要镜检以下特征： （1）各产毒霉菌的菌丝结构，有无隔膜； （2）各产毒霉菌产孢结构的形态特征； （3）各产毒霉菌分生孢子的形态及排列等特征。,五、实验结果,根据菌落形态及镜检结果,参照各种霉菌的形态描述及检索表,确定菌种名称。,
