分子生物学技术-分子克隆技术

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1、2019/6/15,分子克隆技术 Molecular Cloning,分子生物学技术,医科大学检验医学院生命科学学院,2019/6/15,基因工程（gene engineering ）：将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞和生物个体的特性所用的方法及相关的工作。,分子克隆（molecular cloning ）:将某一特定DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的“群体”。,2019/6/15,主要内容,第一节 工具酶 第二节 载体 第三节 分子克隆的基本步骤 第四

2、节 克隆基因的表达,2019/6/15,第一节 工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 T4多核苷酸激酶 核酸酶S1,2019/6/15,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，简称限制酶）：是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。,第一节 工具酶 一、限制性核酸内切酶,2019/6/15,第一节 工具酶 一、限制性核酸内切酶,（一）限制酶的命名与分类,EcoR I,大肠杆菌Escherichia属、 coli种、RY13株中分离到几种限制酶，分别表示为: EcoR I 、EcoR 、EcoR 等。,2019/6/15,作用

3、 ,表3-1 三种限制性核酸内切酶的作用,酶活性 核酸内切酶 核酸内切酶 核酸内切酶 甲基化酶 甲基化酶 ATP酶 DNA解旋酶 DNA链上的 无 有 有 特异识别位点 DNA链上的 无 识别序列内 识别序列外 特异切割位点 在分子克隆中 无 有 无 的重要意义,2019/6/15,（二）型限制性核酸内切酶的作用 型限制酶能识别双链DNA特异的46个碱基对，并在此序列内特异切割DNA。 限制酶功能：根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子。,第一节 工具酶 一、限制性核酸内切酶,回文结构（palindrome structure）：指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所

4、识别）。,2019/6/15,5GAATTC3,EcoR的识别序列：,对称轴,3CTTAAG5 ,2019/6/15,第一节 工具酶 一、限制性核酸内切酶,粘性末端（sticky end）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。,平末端（blunt end）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。,GAATTC CTTAAG,EcoR,CCC GGG GGG CCC,Sma,2019/6/15,第一节 工具酶 一、限制性核酸内切酶,同工异源酶（isoschizomers）:来源不同，但能识别和切割同一位点的酶称为。,同尾酶（isocaudarner）：指有些限制

5、性内切酶识别序列不同，可产生相同的粘性末端,如：BamH 和Bst （G GATCC） Xho 和 Pae R7（C TCGAG）,如： BamH （G GATC C） Sau 3A （N GATC N）。,由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时具有更大的灵活性。,2019/6/15,（一） DNA聚合酶和Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶（ E . Coli DNA polymerase ）是单一多肽链的多功能酶，分子量为109kD，它具有3种酶活性： 5 3 DNA聚合酶活性。 3 5 核酸外切酶活性。 5 3 核酸外切酶活性。,第一节 工具酶 二、 DNA聚合酶,2

6、019/6/15,Klenow片段的主要用途： 补齐双链DNA的3末端，同时可使3 末端DNA标记上同位素。 cDNA克隆中，合成cDNA第二链。 DNA序列分析。,第一节 工具酶 二、 DNA聚合酶,53外切酶 53聚合酶 35外切酶,DNA 聚合酶,(103kD),35kD (小) 68kD(大),C,N,Klenow 片段,2019/6/15,（二） Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶（简称Taq 酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是7080，Taq酶具有53 聚合酶活性和依赖于聚合作用的53外切酶活性。 Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过聚合酶

7、链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增。,第一节 工具酶 二、 DNA聚合酶,2019/6/15,（三）逆转录酶 逆转录酶（reverse transcriptase）是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶。,第一节 工具酶 二、 DNA聚合酶, RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP） 核糖核酸酶H活性（RNaseH） DNA聚合酶活性（DDDP）,逆转录酶的作用：,2019/6/15,2019/6/15,（四）末端脱氧核苷酰转移酶 末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynucleot

8、idyl transferase，TdT，简称末端转移酶）：分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3末端-OH上。,第一节 工具酶 二、 DNA聚合酶, 在载体或目的基因 3末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。 用于DNA 3末端的同位素探针标记。,末端转移酶的功能主要有：,2019/6/15,(A、G、C、T)n,(A、G、C、T)n,(A、G、C、T)n,（1）底物是单链DNA或有3突出末端的双链DNA，需要Mg2+。,（2）底物是平端或3凹端的双链DNA，需要Co2+。,(A、G、C、T)n,2019/6/15,D

9、NA连接酶（DNA ligase）：称为基因工程的缝纫针，它在DNA重组中的主要功能是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5磷酸基团与3羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来，实现DNA体外重组。 DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两种类型。,第一节 工具酶 三、DNA连接酶,2019/6/15,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5-磷酸基团。 主要用途有： 除去DNA片段上的5磷酸以防自身连接。 在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，从RNA或DNA上除去5端的磷酸。,

10、第一节 工具酶 四、碱性磷酸酶,5- pCpGpC -OH 3,碱性磷酸酶,5- CpGpC -OH 3,2019/6/15,第一节 工具酶 五、 T4多核苷酸激酶,5- CpGpC -OH 3,p,+ADP,+ATP,5- CpGpC -OH 3,5- CpGpC -OH 3 +ADP,p* +ATP,2019/6/15,核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分。 其主要作用有： 除去粘性末端以产生平末端。 除去cDNA合成时形成的发夹结构。 分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况。,第一节 工具酶 六、核酸酶S1,+,2019/6/15,第二节 载

11、体,克隆载体 表达载体 穿梭载体,2019/6/15,载体（vector）：指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。,第二节 载体 一、克隆载体,制备的目的基因或外源性DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达。 常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。,克隆载体：能将载体携带的外源基因（目的基因）在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体。,2019/6/15,载体应具备的特征： 能自我复制并具较高的拷贝数。 分子量一般 10Kb。 带有遗传筛选标记。 有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。,第二节

12、 载体 一、克隆载体,多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）：载体上具有的多个限制酶的单一切点（在载体其它部位无这些酶的相同切点 ）,2019/6/15,（一）质粒载体,第二节 载体 一、克隆载体,质粒（plasmid）：是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。,2019/6/15,图4-5 pBR322质粒的物理图谱,pBR322质粒载体,2019/6/15,pBR322质粒是由一系列大肠杆菌质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。 它含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点（Ori），并装有四环素

13、抗性（Tetr）基因和氨苄青霉素抗性（Ampr）基因供菌落筛选。 在这两个抗性基因中分别含有BamH I和Pst I等限制酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。,2019/6/15,图4-6 pUC质粒物理图谱,pUC18、pUC19质粒载体,2019/6/15,pUC系列载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的双链DNA质粒载体。 pUC18和pUC19质粒长约2.69Kb，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同。 pUC质粒含Ampr，可供菌落筛选。载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的DNA片段（lacZ基因），该基

14、因编码-半乳糖苷酶氨基端的一个片段，IPTG可诱导此片段合成，而此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（-互补），形成完整的-半乳糖苷酶,2019/6/15,第二节 载体 一、克隆载体,（二）噬菌体载体,（三）粘性质粒(cosmid),（四）酵母人工染色体,（五）动物细胞基因克隆的载体,猿猴空泡病毒40（SV40）载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体,2019/6/15,外源目的基因在新宿主细胞中是否克隆成功，是通过鉴定克隆是否表达的方法来证实，即产生克隆基因所编码的蛋白质，其每个环节都至关重要 。 真核基因在原核细胞中表达需要有效转录及一系列调控元件，必须保证外源基因插入方向

15、的正确性；受原核启动子的控制；必须能在大肠杆菌中有效转录和有效翻译。 基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于基因的有效转录、mRNA正确的翻译和翻译后加工。,第二节 载体 二、表达载体,表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体，带有表达所需的各种元件。,2019/6/15,（一）原核细胞表达载体 原核细胞的表达载体主要是大肠杆菌表达载体。外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。大肠杆菌表达载体是在克隆载体的基础上导入表达系统调控元件：启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。,第二节 载体 二、表达载体,2019/6/15,第二节 载体 二、表达载体,如乳糖启动子（Lac）、色氨酸启动子（Trp）、Tac启动子（Trp-Lac）以及PL和PR启动子等。,原核细胞启动子示意图,（一）原核细胞表达载体 1. 启动子（pr