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1、运用抗菌肽（AMPs）和等速电泳对细菌的连续性微流体分析检测摘要：我们提出了一种对于水中细菌的连续定量检测的新微流控分析技术。我们利用等速电泳（ITP）聚焦技术，在微流体通道中打造了一个携带荧光标记的高浓度抗菌肽（AMPs）固定区。被测试的水样本从高浓度抗菌肽（AMPs）反应区连续流过，任何存在于样本中的细菌被同时标记，并从高浓度抗菌肽（AMPs）中分离。被标记了的细菌继续前进，进入下游的缓冲区后，在那里进行荧光信号的监测。这一过程实现了对样本中细菌浓度的直接定量测量。目前，我们通过大肠杆菌的定量检测实验证实了该技术的可行性。同时，超过1个小时的监测时间说明了该技术具有较好的稳定性。除此之外，
2、我们为不同的分析条件，提供了一个用来预测装置性能的简单模型。该技术不仅可以扩展到其它类型的探针分析检测中，在提供连续分析的同时，还可对样本中特定的点的进行单独检测。饮用水质量问题仍然是造成全球性大规模死亡的主要原因之一。世界卫生组织（WHO）估计，每年340万起与水有关的死亡案例中，就有220万人因腹泻引起的疾病而死。这个问题并不仅限于发展中国家，在20092010年，仅在美国就有33个与饮用水有关的疫情报告，包括1040例疾病，85人住院，9人死亡。然而，大多数的感染是可被避免的对水体进行检测。水中的微生物检验的常规方法是将过滤后的样本在选择性培养基上的培养，再对培养出的菌落进行分析。这个检
3、验过程需要一个专门的生物安全实验室和一批训练有素的人员分别在24和72小时下完成。两次实验的时间差在跟踪污染和防止疾病传播上是至关重要的。快速检测技术基于基因型分析法与免疫测定法。特定目标核酸的酸序列基因型方法，典型的有rRNA或DNA，和利用扩增技术的方法：例如，比栽培方法（通常24小时）更精准的，更具体的，和更快的聚合酶链反应（PCR）。尽管，最近研究人员在PCR扩增方法上有很大的进展，但一个无菌的环境，一个专门的实验室和一批训练有素的人员通过多个样本的预处理来纯化核酸仍旧是必须的。免疫依靠细菌的特异性结合或结合菌株特异性抗体（AB）来瞄准目标细菌。传统的同时也是大多数建立的免疫分析技术是
4、运用酶联免疫吸附测定（ELISA）和它的变体，利用该变体的表面固定化抗体，捕获样本中的目标抗原。ELISA的现代版则是运用免疫磁性分离技术（IMS），表面等离子体共振技术（SPR）以及固定碳纳米管，但在原理上并没有多大的改变。AB型方法的一个重要的优势是能够捕获存活的细菌，并可进一步研究和分析。但是，高成本的试剂（主要是抗体），多个较复杂的洗涤步骤，以及表面功能化的控制，这些在很大程度上限制了相关的实验采用此方法进行研究。因此，现在这种分析方法已经不再被广泛地使用了。 图1 （一）单直槽最简形式分析示意图。（a）荧光标记的抗菌肽（AMPs），最初在尾随电解质（TE）储层混合，通过阳离子等速电泳
5、（ITP）聚集技术和真空驱动的逆流来固定（b）相似的，真空线也不断从前导电解质（LE）储层吸引存在潜在感染的水流。（c）任何在水中存在的细菌通过高浓度抗菌肽（AMPs）区时，在局部加速反应下被瞬间标记。被标记的细菌继续下行，而游离的抗菌肽（AMPs）仍然被固定在等速电泳（ITP）区，从而减少对下游信号检测的影响。（d）进一步下行，荧光信号由检测器显出。该信号对应于通过探测器的单个细菌以及样本中的细菌浓度。（二）荧光显微镜图像显示，在高浓度抗菌肽（AMPs）区大肠杆菌O：416的标记。可以清楚的从接口看到，最初未标记的细菌通过反应区时被瞬间标记。而游离的抗菌肽（AMPs）仍被固定在等速电泳（IT
6、P）区。近年来，人们在运用微流体平台检测病原体的技术上有了显著的进步。虽然连续监测是非常理想的水质监测方法，但由于大多数情况下分析技术的能力有限，只能分析单一或有限数量的样本。这主要是因为其在样本预处理步骤存在难以攻克的难题：如细菌裂解，标签，洗涤，或过滤，这些步骤很难在一个连续的方式中实现。等速电泳（ITP）是一种电泳技术，基于其有效电泳迁移率，能够使离子分子分离或富集。该技术的特性在于：不连续的介质通过缓冲系统（LE）电解质和（TE）电解质，具有特定电泳迁移率的带电分析物，在对电泳施加一个电场后，会集中在一个狭窄的LE-TE界面。本技术已被证实能使被测物浓度在2分钟内产生高达一百万倍的增加
7、。最近的一些关于等速电泳（ITP）技术检测细菌的研究，例如：贝科维奇等人运用分子信标探针和等速电泳（ITP）技术，利用加速反应从细菌裂解液中检测出了16个rRNA基因。彭和奥卡塞恩等人运用等速电泳（ITP）技术，在样本预处理步骤避免了细菌的裂解。然而，这些方法仍然需要对样本做预处理（片外滤波和荧光预标记），因此只能对有限体积的样本进行分析。同样地，虽然现有的技术确实可以提供准确的水样本定性分析，但仍旧缺乏进行连续分析和实时监控的能力。在现有的传染病病原体检测对连续检测技术的需求下，连续检测技术经过简单的自动化和标准化后将具有巨大的发展潜力。最近研究出了使用抗菌肽（AMPs）来识别和标记细菌的替
8、代分子技术。抗菌肽（AMPs）是较短的带正电荷的肽，是许多生物体先天防御系统的一部分，用于抵抗微生物感染。它们与细菌带负电的外膜特异性结合，可根据抗菌肽（AMPs）的类型通过某种机制诱导微生物杀灭细菌。抗菌肽（AMPs）具有结合带负电荷的细菌外膜的的能力，将他们的作为细菌探针。AMP基检测虽然不能像PCR和ELISA技术一样利用高特异性来直接比较，但它是作为细菌存在初检测的最理想的方法之一，它能够指导进一步的分析和处理步骤。例如，AMP基检测具有排除细菌感染的能力，这在医学诊断中具有较大的优越性，正如其在血液培养试验中产生了高达85%的负回报（即表明没有细菌生长）。我们在这里提出的概念和特性，
9、第一，证明了一种新型的微流体方法能够对水样本中的细菌进行连续的监测，无需对样本进行预处理。我们通过逆流和阳离子等速电泳（ITP）聚焦技术建立了一个高度集中的荧光标记的抗菌肽（AMPs）稳定区。水样本不断通过高浓度反应区，出现在样本中的细菌通过狭窄的抗菌肽（AMPs）区时，被瞬间标记，并且被带到下游的缓冲区。我们证实了该方法对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌能够进行长期稳定的定量检测。在我们的实验结果的支持下，我们在理论上建立了一个简单而又详细的模型。当细菌进入通道后，这个模型能够帮助我们算出抗菌肽（AMPs）探针与细菌的外膜特异性结合的效率，这使我们能够在不同的检测精度下预测出实操作所需的条件。测定
10、法的原理图1说明了最简单的测定原理。设想一个简单的长度为L的直流体微通道连接两个储层。我们使电解质（LE）溶液充满东储层，电解质（TE）溶液充满西储层。在通道上施加电场，建立阳离子等速电泳（ITP）并将一定的抗菌肽（AMPs）聚焦在LE-TE界面。我们在TE储层内形成负压，来阻止抗菌肽（AMPs）的迁移。负压驱动水流以平均速度流动，该速度与电迁移速度满足= .的关系。接下来，我将介绍水样本的储层。当样本中存在的细菌在逆流和电迁移的共同影响下（由于细菌带负电荷），向下游的抗菌肽（AMPs）区前进。LE-TE界面接口在这里扮演了两个角色：第一，由于反应速率与反应物浓度成正比，高浓度抗菌肽（AMPs
11、）使LE-TE界面上的密闭反应区（抗菌肽与细菌外膜结合反应）中的反应速度明显增加。第二，LE-TE界面作为特异性滤波器，能使水样本中的带负电荷的细菌自由通过，同时将抗菌肽（AMPs）固定在密闭的反应区空间内。因此，所有的细菌样本被依次标记后，会从高浓度的抗菌肽中分离而出。已被标记的细菌继续下行，其荧光信号可被监测。通过对显出的信号进行分析，我们能够对样本中细菌的最初浓度进行定量测量。正如“支持信息”所示，动态的分析和标记过程的实时视频监测是可行的。细菌沿通道的截面平均速度在任何点上的可以表示为 （1）（2）双指数(.)B,i指的是细菌（B）在i区的属性，对应于LE或TE界面（分别是i =L或T
12、）。是在施加在这个区域的电场，指的是细菌的有效电泳迁移率，这里我们假定其是恒定的迁移区域。指在平均压力下驱动的流速。等速电泳（ITP）的操作条件决定了=，并通过等速电泳（ITP）平均流速可得=-，由此我们得到 （3）和分别指前导和尾随离子的有效电子迁移率。细菌量（在LE和TE区显然是相等）可被表示为其中指的是i区细菌浓度，是该区域的横截面积。值得注意的是，由于横跨等速电泳（ITP）的不连续性电场接口，细菌浓度在TE区可能不同于（通常小于）细菌在LE区的初始浓度。通过质量守恒定律和计算LE和TE之间潜在的横截面面积的变化，得 （4）（LOD）检测法的检出限是由细菌进入通道的通量决定的；理论上该检
13、测是离散的，甚至是一个单一的被标记的细菌都可以被检测到。然而，在较低的细菌浓度下，细菌进入通道需要较长的时间。通过细菌在样本中的浓度，我们得到在已知的LE区中细菌通量的最简便的表达式： （5）因为这里所有的迁移率是显出数量，所以 的差值始终是正值。例如在样本中，假设细菌的浓度是，单位是cfu/（1cfu /mL= cfu/），然后对于第一个细菌来说用于检测的特征时间尺度是简单的 = 1 / QB。显然，电领域越高截面区越大，在一个固定的检测时间内，较高的LE电子迁移率有助于检测限的下降。另一个影响LOD参数的因素是细菌通过抗菌肽（AMPs）区被标记的效率。假如把抗菌肽（AMPs）区的结合反应看
14、做一个细菌表面的外膜和生物分子的反应（受朗格缪尔动力学支配），细菌（表面探头）浓度受抗菌肽（AMPs）（目标分子）限制：（6）其中指的是游离的抗菌肽（AMPs）的浓度，指的是受体探针在细菌表面的总密度，指的是表面束缚电流密度，和分别指的是反应进行中的反应速率常数和反映未进行的速率常数。这些参数由细菌或探针的性质决定，所以对于不同的菌株和探针，不能直接修改数据进行计算。同时，这些参数可以在不同条件下通过部分标记效率估算得到（即，测量/）。反应速度的特征时间尺度可通过 = 1/()得出。为了得到足够数量的标记，这一次的特征时间尺度与细菌的平流时间尺度相比必须足够的短，细菌的平流时间尺度的表达式为
15、=/，其中 指的是抗菌肽（AMPs）区的宽度，指的是细菌通过反应区的速度。上述条件可表示为 或是 （7）因此，对于给定的抗菌肽（AMPs）区的浓度，和动力学速率，以及，可以通过计算得出在充分标记细菌的条件下，细菌通过反应区的最大速率。同时可推算出电场大小的上限以及系统的最佳通量。由于抗菌肽的反应速率没有明显的特征，我们用实验的方法来估算标记的效率。接下来，我们会对实验装置部分做出进一步说明。 实验装置化学品和抗菌肽（AMPs）. 等速电泳（ITP）缓冲器 我们的阳离子等速电泳（ITP）是使用由100mM NaOH和200 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）形成的LE缓冲液和由10mM的吡
16、啶和20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）形成的TE缓冲液。为了抑制电渗流（EOF），我们还添加了1% 1-丙二醛聚（乙烯基吡咯烷酮）（PVP）到缓冲区。所有的缓冲部件是由西格玛-奥德里奇，（圣路易斯，莫）提供的。准备阶段需要纯化超纯DNA酶/ RNA酶的蒸馏水（超纯水净化由美国马萨诸塞州比尔里卡的Millipore公司提供）。抗菌肽（AMPs） 我们在本研究中使用罗丹明（TAMRA）标记形成法，5-羧基四甲基罗丹明由Biomatik公司合成（位于美国特拉华州的威尔明顿）。Indolicidin是目前自然界中来源于牛中性粒细胞的多肽抗生素，它对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的活性具有很强的杀菌活性，同时对原生动物也有很强的杀伤
