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1、1广东巨大儿发病率调查及高危因素分析【关键词】广东巨大儿发病率高危因素A:ImmunohistochemicalstainingwithantiinsulinantibodyofisletgraftsinMSCgrouponday15aftertransplantation;B:Immunohistochemicalstainingwithantiinsulinantibodyofisletgraftsincontrolgrouponday15aftertransplantation;C:Immunohistochemicalstainingwithanti-CD40LIgantibodyof
2、isletgraftsinMSCinfectedwithCD40LIggenegrouponday30aftertransplantation;SP,originalmagnification200在前期研究中,我们利用羊膜建立诱导体系将小鼠胚胎干细胞定向诱导为表皮样细胞(epidermal-likecells,ELC),形态学上呈现典型的表皮样单层细胞,免疫组化染色显示,分化后的 ELC 表达表皮特异标志物 1 整合素(1-integrin)?角蛋白 19(cytokeratin,CK19)和角蛋白 15(CK15)1?将已诱导的胚胎干细胞植入裸鼠皮下获得的瘤体进行病理切片,可见大量表皮样和
3、表皮附属器样结构?这表明羊膜诱导体系能够将胚胎干细胞诱导为表皮细胞,诱导后的细胞具有分化为表皮及表皮附属器的潜能2?但从胚胎干细胞分化为 ELC 的过程中,基因表达谱系的时空变化?起关键作用的信号通路以及相关的表观遗传学调控机制等尚不清楚?本研究先行从全基因组表达芯片分析入手,筛选出分化前后发生显著差异表达的基因,通过基因本体(geneontology,GO)分析和通路(pathway)分析方法初步明确这些差异表达基因的大体分类和参与的信号通路,为进一步寻找决定分化方向的关键基因及其调控机制奠定基础?1 材料与方法1.1 材料ES-BALB/c 小鼠胚胎干细胞(中山大学附属眼科中心黄冰教授惠赠
4、)?滤膜孔径为 3m 的双层 6 孔培养板(Transwell),购于 Costar 公司?DMEM(DulbeccosmodifiedEaglesmedium)?小鼠白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor,LIF)胰蛋白酶和胎牛血清均为 Gibco 公司产品;TRIZOL 为 InvitrogenLifeTechnologies 公司产品;氯仿为上海化学试剂有限公司产品;异丙醇为上海化学试剂有限公司产品;无水乙醇为上海化学试剂有限公司产品;InvitrogenSuperscript 双链 cDNA 合成试剂盒为 Invitrogen 产品;单标DNA 试剂盒?杂交系
5、统 4 均为 NimbleGen 公司产品?1.2 方法1.2.1羊膜制备取足月妊娠剖腹产的胎膜,钝性分离除去绒毛膜,用含庆大霉素的生理盐水反复冲洗,去除血污,剪切成大小约为 3mm5mm 方形,浸泡于ESC 培养液中备用?21.2.2ESC 体外诱导分化取传代培养 48h 的 ES-BALB/c 细胞,以 1.25g/L胰蛋白酶-EDTA 消化液消化,按 5108cells/L 接种于双层 6 孔培养板的下层,然后将制备好的羊膜置于双层培养板的上层,用无 LIFESC 培养液培养?每隔 24h 将培养液换掉一半,培养 3d,倒置镜下观察细胞形态变化?1.2.3RNA 抽提TRIZOL 法提取
6、小鼠的 ESC 及诱导后的 ELC 的总 RNA,将1mLTRIZOL 试剂直接加入 6 孔板中反复吸充分裂解细胞;酚氯仿两相分离,RNA 全部分配在水相,将水相转移异丙醇沉淀 RNA,离心收集,去上清;每 1mLTRIZOL 试剂匀浆的样品中加入至少 1mL 的 750mL/L 乙醇,清洗 RNA 沉淀,振荡离心;去除乙醇溶液,空气中干燥 RNA 沉淀 510min,加入无 RNA 酶的水用枪反复吹打几次,然后55 到 60孵育 10min?获得的 RNA 溶液保存于-70;紫外吸收测定法测定 RNA 的纯度及浓度;变性琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整度?1.2.4cDNA 的合成与样本荧
7、光标记双链 cDNA 的合成采用InvitrogenSuperscript 双链 cDNA 合成试剂盒(Invitrogen,11917-020)提供步骤合成 cDNA,以总 RNA 平为模板,采用 OligodTPrimer 反转第一链,T4DNA 聚合酶系统合成第二链 cDNA;用 RNaseA 消化掉多余的 RNA 残留;采用 NimbleGen 单标kit,Cy3-RandomNonamers 标记,标记产物根据浓度,计算每管 Cy3 标记的样本的量,并参照“RNA_cDNA_LabeledDNA-QC”指控情况来进行下一步的杂交实验?1.2.5全基因表达谱芯片杂交所用芯片为上海康成生
8、物提供的Musmusculus12X135kv2array 小鼠全基因表达谱芯片,芯片含有 13 万 5 千根60mer 长的探针,共含有小鼠基因数 44170,每个基因的探针重复数 3 次,源于数据库 NCBIMM9?ELC 和 ESC 分别于芯片杂交,每组 3 次生物学重复,共 6 张芯片?采用NimbleGen 杂交系统 4 进行杂交,将标记好的样本充分溶于 VWR 水中,再与NimbleGen 的杂交液 kit 按比例配好(3.3L8.7L)按操作说明进行一系列反应步骤,整个过程需避光,最后放入杂交盒中 4216h 反应,反应完成后洗脱,离心甩干?1.2.6图像采集和数据分析芯片结果由
9、 Axon 的 GenePix4000B 单通道扫描仪进行扫描读取,采用 NimbleScanv2.5 读取芯片原始信号值并对读取的信号值进行修正及标准化处理,将芯片读取后的数据采用 GeneSpringv11.0 软件进行诱导的 ELC 组与 ESC 组进行比较分析其差异变化分析?设定阈值为2,FoldChange2 为上调,FoldChange2 为下调,并 NimbleScanv2.5 对基因表达谱进行基因注释,并对全基因进行 GO 及 Pathway 功能分析?1.2.7实时定量 PCR 验证挑选信号通路中变化大的差异基因,进行验证?依照 GenBank 序列号获取全长 cDNA 序列
10、,由上海康成生物设计并合成上下游引物?在ABIPRSIM7900 检测仪上进行 SYBRGreen 法荧光定量 PCR 检测?各样本的目的基因及管家基因分别进行实时定量 PCR 反应?根据梯度稀释 DNA 绘制标准曲线,各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成?每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度,即为此样品此基因的校正后的相对含量?1.3 统计学处理3采用 NimbleScanv2.5 对芯片进行扫描,获得原始信号值;GeneSpringv11.0软件分析对芯片结果原始信号值进行标准化,T 检验比较样本之间的差异表达情况?2 结果2.1ESC 分化前后的形态学变化ES 在分化前
11、呈现巢式生长,集落大多呈圆形态或椭圆形态,边界光滑,细胞排列紧密,细胞边界不清(图 1A);诱导 3d 后,细胞形态出现明显变化,细胞大而扁平,呈多边形,排列紧密,细胞边界清晰,呈典型单层上皮样改变(图 1B)?2.2 样本 RNA 质量检测ESC 组和 ELC 组各制备 2 次重复样本(每组随机选取一份样本做基因芯片的平行重复实验),进行总 RNA 的抽提,4 份样本的 D(260/280)值均在 1.82.1 范围内,D(260/230)值均大于 1.8,说明 RNA 纯度高,可用于后续实验?浓度在11093205ng/L 之间,每管样本共 30L 的量,样本量充分足够实验所需?2.3 基
12、因表达谱芯片数据差异分析采用 NimbleGen12X135K 小鼠全基因组表达谱芯片进行杂交,样本采用 Cy3 绿色荧光标记(图 2)?从 6 张芯片扫描图上可见每张芯片信号均匀,清晰没有边缘化效应?刮伤等影响信号值,阳性定位点和阴性对照区域结果明显?利用小鼠全基因表达谱对 ESC 及诱导后的 ELC 进行检测发现,在总共 44170 个基因转录本中,有25285 个基因转录本有表达,占总转录本的 57.2%;应用软件 GeneSpringv11.0,对结果进行差异分析,在差异表达谱中显示 ESC 与诱导后的 ELC 差异基因多达 4856个,且在统计学意义范围内 P 值0.05,cutof
13、f=2;其中上调基因数为 2659 个,下调基因数为 2197 个?采用常见的层次聚类法(Hierarchicalclustering)对 6 个芯片的结果进行分析,显示同组样本聚集程度好,小鼠 ES 和诱导后的 ELC 明显区分开(图 3)?2.4 基因表达谱 GO 及 Pathway 生物信息学分析通过 GeneSpringv11.0 软件对 6 张小鼠的全基因表达谱芯片的差异基因进行注释系统(geneontology)分析和信号通路(pathway)分析,探讨这种共表达现象在生物学上的意义?分析结果显示在 GO 三大类中,生物学过程(biologicalprocess,BP)?分子功能(
14、molecularfuction,MF)?及细胞组分(cellularcomponent,CC)总共有 3735 个基因表达水平发生了变化?按照可信值由高到底排列各挑选前 10 位的注释情况见(表 1)?在 Pathway 分析结果中显示共有2987 个差异表达的基因发生了变化,并挑选可信值高的前十位进行分析见(表 2)?2.5 荧光定量 PCR 实验对结果进行验证分析4结合全基因表达的 GO 分析及 Pathway 分析挑选出可信值高,并可能在小鼠ESC 诱导 ELC 相关的基因做进一步的芯片验证实验,以证实芯片的结果的可靠性?我们这里挑选了 GO 中的生物学过程(BP)的细胞黏附因子(ce
15、lladhesion)过程和pathway 中的细胞周期(cellcycle)的 5 个基因(CCND2?CDK7?CDH17?PCDH12 和CNTN1)做验证,验证显示挑选的基因的芯片差异结果和 RT-PCR 结果趋势一致的(图 4),各基因在两组样本间的表达水平具有显著差异(P0.05),表明芯片数据真实可靠,可为后续的功能研究提供依据?3 讨论细胞分化是一个从全能到多能,最后到专能,外延不断缩小,内函不断扩大的过程?在这个过程中,基因组并未发生明显的序列变化,而是通过基因表达有序的时空变化实现的,即基因表达谱的变化?基因表达谱的变化控制蛋白组的变化,进而控制细胞功能和表型,因此,基因表
16、达谱有序的时空变化是个体发育过程中的主旋律,其中隐藏着大量与生命发生有关的玄机?从表达谱比对入手,可望阐明细胞定向分化的关键调控机制,为细胞分化?个体发育研究进行理论和方法学探索?全基因表达谱芯片技术作为基因组学研究的工具,经过多年的发展和检验,已是一种成熟,可靠的常用技术?这种技术可以将某一空间和时间的样本转录组水平的表达情况整体的展现出来?这里我们研究采用的是 NimbleGen 公司的 12X135k 的芯片,基因组设计源于 NCBIMM9 权威数据库,每张芯片含有 13 万 5 千根探针含有 44170个小鼠转录本基因信息,每个转录本基因有三次特异性探针技术重复设计,每个基因的长寡核苷酸探针的长度为 60mer,可以提供更高的信噪比?灵敏度?专一性和辨别能力?使用该芯片检测出小鼠 ESC 及诱导后的 ELC 的差异表达谱,得到关于影响小鼠 ESC 诱导为 ELC 的大量宝贵的基础信息,为进一步研究其中的发生机制提供了依据?GO 分析是对差异表达的基因进行生物学功能进行
