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1、1幽门螺杆菌粘附素基因 alpA 的克隆与高效表达作者：白杨张亚历王继德杨云生张兆山周殿元【关键词】,螺杆菌关键词:螺杆菌，幽门;粘附素 alpA;克隆，分子;基因表达摘要:目的克隆并表达幽门螺杆菌粘附素 AlpA 基因.方法提取幽门螺杆菌染色体基因，用 PCR 方法扩增 alpA 基因，将其克隆至表达载体 pET-22b（+） ，转化大肠杆菌 BL21（DE3） ，IPTG 诱导表达.结果分离得到了 1.5kb 的 alpA 基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达，在 37诱导表达 3h 后，表达产物占细菌总蛋白的 31.9%.表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在，其中主要是包涵体的
2、形式，目的蛋白占不溶性蛋白的 64.8%.结论幽门螺杆菌 alpA 基因的克隆与表达为 Hp 疫苗的研制打下了基础.Keywords:helicobacterpylori;adhesionalpA;cloningmole-cular;geneexpressionAbstract:AIMToisolateandexpressealpAgenefromHe-licobacterpylori.METHODSThealpAgenewasamplifiedfromH.pylorichromosomalbyPCRandinsertedintotheprokaryotieexpressionvectorpE
3、T-22b（+）.TherecombinantplasmidwastransformedintotheBL21（DE3）E.colistrain.RESULTS1.5kbalpAgenewassuccessfullyisolated.Re-combinantE.colistrainsexpressedAlpAwereobtained，theexpressionproteinamountedto31.9%ofthetotalbacterialproteinafterinducedwithIPTGfor3hat37.CONCLUSIONCloningandhigh-expressionofalpA
4、genelaythefoundationforthedevelopmentoftheH.pylorivaccine.0 引言幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）已被确认是慢性胃病（包括胃炎和消化性溃疡）的主要病原因子，同时与胃腺癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生亦密切相关1-6.目前根除 Hp 的主要手段是抗菌疗法，但有相当的局限性.疫苗接种最有效，在 Hp 疫苗的研制中，获得了不同程度的保护作用，但仍不理想.如从粘附素出发寻找保护性抗原从而阻断 Hp 对于胃粘膜的粘附，使之在胃蠕动时随食物一起被排空，也许是一种有益的尝试.AlpA 是已被证实的 Hp 粘附素中的一种7 ，
5、目前国内尚未见有关的研究报道.我们对粘附素 AlpA 的基因进行了克隆和表达，为构建 Hp 基因工程疫苗打下了基础.1 材料和方法1.1 材料菌株 BL21（DE3） 、质粒 pET-22b（+）和幽门螺杆菌 SS1 为本所保存.限制性内切酶 Not，Noc及 T4DNA 聚合酶、VentDNA 聚合酶购自2NewEnglandBiolabs 公司，TaqDNA 聚合酶、DNA 相对分子质量标准DNA/EcoR+Hind购自华美生物工程公司，琼脂糖、dNTPs、DNA 快速纯化试剂盒购自 Promega 公司，测序质粒纯化试剂盒购自德国 Qiagen 公司，其他试剂为国产分析纯.1.2 方法从
6、固体培养基上刮取生长良好的 Hp 菌落，按基因组 DNA 小量制备法提取 Hp 染色体 DNA.质粒的快速抽提及大量制备均采用碱变性法.根据文献8设计引物，在其 5端加上合适的限制性酶切位点，由博亚公司合成.序列如下:AlpA1:5-TGGCCATGGATTGCGCTAGCATAAGTTA-3NocAlpA2:5-AGTGCGGCCGCGAATGAATACCCATAAGA-3Not热启动法进行 PCR，95变性30s，55退火 50s，72延伸 90s，35 个循环后再延伸 10min.8gL-1琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果.质粒和目的基因 DNA 经 Not和 Noc双酶切，玻璃奶回收酶切片段
7、，T4 连接酶作用下 16连接 12h，转化宿主菌 BL21（DE3）.重组转化子经筛选和鉴定后，采用 373ADNA 自动分析仪进行全自动测序.AlpA 阳性克隆经 IPTG 诱导表达后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.外周质部分表达产物:4，12000g 离心 1min，收集 IPTG 诱导培养物.将细菌沉淀重悬于30mmolL-1Tris-CL（pH8.0）1mmolL-1ED-TA-200gL-1 蔗糖中，冰浴 10min，以 12000g 离心 10min，上清即为外周质部分.胞内可溶性和包涵体部分:同上法收集 IPTG 诱导培养物菌体.弃上清，菌体沉淀重悬于 1/10 体积的 PBS
8、中，在冰浴条件下超声破碎至溶液较清亮，以12000g 于 4离心 15min，上清即为胞内可溶性部分，沉淀为包涵体部分.2 结果2.1 粘附素 AlpA 基因片段的序列粘附素 AlpA 基因 PCR 扩增结果电泳分析发现在 1500bp 左右有一条带，大小与预计相符（Fig1）.将 PCR 产物经 Not和Noc双酶切后，定向插入经同样双酶切的 pET-22b（+）载体中，获得重组质粒命名为 pET-22b（+）/AlpA（Fig1）.重组质粒经 Not和 Noc双酶切后电泳初步鉴定结果与预期相符.直接以重组质粒 pET-22b（+）/AlpA 为模板进行测序，得到了克隆片段的 DNA 序列，
9、与 Odenbreit 等6报道的几乎一致，同源性高达 97.3%.2.2 粘附素 AlpA 基因在大肠杆菌中的表达将粘附素 AlpA 阳性克隆株在LB 培养液（含 100mgL-1 氨苄青霉素）中 37过夜培养，然后按 1%转接至含氨苄青霉素的 LB 培养液中，继续培养至 A 值为 0.60.8，加 IPTG 至终浓度为 0.1mmolL-1，诱导表达 3h，离心收集菌体，取其周质的渗透休克液、菌体超声后的上清以及沉淀进行 100gL-1SDS-PAGE 电泳分析（Fig2）.结果发现，经诱导后表达 Mr 为 56500 的蛋白，与预期一致，凝胶自动扫描分析，其粘附素 AlpA 重组蛋白占菌
10、体总蛋白的 31.9%，其中可溶性表达占上清的 23.7%，包涵体占沉淀的 64.8%.图 1图 2 略3 讨论在当前以尿素酶 B 亚单位为主的多种候选抗原预防幽门螺杆菌感染效果不确定的情况下9 ，提示我们需发现新的保护性抗原.有关文献表明10 ，外膜蛋3白（OMP）和膜孔素也许是优秀的疫苗候选成分，而 AlpA 正符合上述要求:AlpA 与 Hp 外膜蛋白膜孔素家族的 HopC 的同源性高达 97.2%;体外粘附实验表明 AlpA 位于细菌表面.此外，AlpA 作为基因工程疫苗的候选抗原还具有下列优点:位于细菌表面从而为免疫反应提供靶位;作为粘附素为 Hp 致病所必须，具有较高的保守性，而保
11、守抗原通常为疫苗构建的首选抗原;尽管是 Hp 致病的必须成分，但本身无毒性且与人组织抗原无交叉反应;因其成分为蛋白质，从而能够通过构建基因工程疫苗实现大规模生产和纯化.这些优点符合 Har-ry 等11在 1998 年提出的 Hp 疫苗抗原的标准.我们在设计引物时去掉了 AlpA 信号肽序列，为便于下一步的表达和纯化，又将其装入了带有组氨酸尾巴的融合表达载体.PCR、酶切鉴定和测序结果显示获得了特异的 Hp 的 alpA 基因，蛋白电泳分析表明获得了高效表达 HpAlpA 的克隆株，为进一步研究其粘附机制和免疫保护作用奠定了重要的基础.参考文献:1LiuXF，HuJL，PengDR，SongB
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