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1、1副溶血性弧菌流行群特异多重 PCR 鉴定【摘要】目的建立适于基层单位应用的针对副溶血性弧菌流行群的特异多重PCR 方法。方法查找副溶血性弧菌的基因序列，将当前流行群的序列和以往副溶血性弧菌的序列进行比较，设计针对流行群的 PCR 引物，并进行多重 PCR 扩增。结果运用群特异多重 PCR 法可特异性的扩增出当前流行群副溶血性弧菌的目的基因片段，可大大缩短鉴定时间。结论群特异多重 PCR 法能快速鉴定当前副溶血性弧菌流行群，有利于流行病学溯源等。【关键词】副溶血性弧菌副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,Vp)是一种嗜盐性细菌。人由于生吃或食用未煮熟的海产品常引起食源性感
2、染，导致急性胃肠炎1 。副溶血性弧菌可分为 13 个 O 血清型和 71 个 K 血清型2 ，当前流行的副溶血性弧菌以O3:K6、O4:K68 和部分 O1 血清型为主。研究显示，这些血清型别的菌株在基因型别上几乎一致，因此，被称作流行群3-5 。常规检测副溶血性弧菌的方法大多要经过增菌、选择性培养、生化鉴定和血清学反应等过程，操作繁琐、耗时长、检出率低，不利于及时诊断和流行病学溯源。为克服副溶血性弧菌常规检测方法的不足，我们建立了适合基层单位应用的群特异多重 PCR 方法，以期能进行副溶血性弧菌流行群的快速鉴定和流行病学溯源中发挥积极作用。现将结果报告如下。1 材料与方法11 菌株大肠埃希菌
3、 1 株；金黄色葡萄球菌 1 株；副溶血性弧菌 11 株，其中血清型 7 株，均为 O3:K6 株，O4:K68 株 2 株，O1：K25 株 2 株。所有菌株均为本中心实验室在食源性监测标本中分离所得。12 多重 PCR 引物设计根据副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因tdh（GenbankAccessionNo：D90238）设计针对扩增部分 tdh 基因片段的引物，P 上:5-GACTGTGAACATTAATGA-3，P 下:5-CGATTCTTTGTTGGATATAC-3，扩增产物 360bp 左右。查找副溶血性弧菌的基因序列，将当前流行群的序列和以往副溶血性弧菌的序列进行比较，根据流行群特
4、异的 toxRS/new 基因（GenBankAccessionNo：L11929）设计扩增 850bp 左右的引物，P 上:5-TAATGAGGTAGAAAC-3，P 下:5-CGTAACGGGCCTACA-3。13 菌株培养和模板 DNA 提取菌株复苏后，接种于相应增菌培养基培养1824h，然后转种至相应的选择培养基培养 1824h。在平板上挑取 23 个单个菌落与 100l 灭菌纯水研磨混匀，9510min，10000r/min 离心 5min，取上清作为 DNA 模板。14 多重 PCR 扩增目的基因和扩增条件优化分别采用单一引物对扩增相应目的基因片段，进行 PCR 扩增条件的摸索，接
5、着进行多重 PCR 扩增条件的筛选和优化。最后采用的多重 PCR 扩增条件是 50l 的 PCR 反应体系中含 10PCR 反应缓冲液 50l ，25mmolMgCl230l ，10mmoldNTP10l ，tdh 上游引物（25pmol/l）10l ，tdh 下游引物（25pmol/l）10l ，toxRS/new 上游引物（25pmol/l）10l ，toxRS/new 下游引物（25pmol/l）10l ，模板 DNA50l ，Taq 酶（5U/l）06l ，灭菌双蒸水补足至总体积50l。将 PCR 反应体系置于 PCR 热循环仪上，945min；9430s，4530s，7260s 共
6、30 个循环。最后，72延伸 10min。215 电泳检测取 5lPCR 产物和 1l6上样缓冲液充分混匀置 20 琼脂糖凝胶含溴化乙锭（EB）05mg/L 电泳。电压 5v/cm,电流 40mA，电泳缓冲液 05 三乙基硼烷（TBE） 。凝胶成像仪观察结果并拍照。16 敏感性试验从 TCBS 培养基 37培养 1824h 的副溶血性弧菌中刮取菌落用灭菌双蒸水配成菌悬液,活菌系列稀释菌落计数后,再以灭菌双蒸水对副溶血性弧菌菌株进行 103108cfu/ml 的稀释,从各稀释度中取 100l 做 PCR，进行敏感性评价。2 结果21 单一引物 PCR 扩增（图 1、图 2）tdh 基因片段引物能
7、扩增出 11 株流行群副溶血性弧菌，产物大小约为 360bp 左右，在图 1 中，111 泳道为流行群副溶血性弧菌，有目的条带。而在同一条件下扩增的大肠埃希菌、金黄色葡萄菌均未扩增出目的片段，图 1 中 12 和 13 泳道分别是大肠埃希菌和金葡菌，均未见目的条带；toxRS/new 基因同样在 11 株流行群副溶血性弧菌能扩增出 850bp 左右的目的片段，而同时参与扩增的大肠埃希菌、金葡菌均未见目的片段。图 2 中，111 泳道为流行群副溶血性弧菌，有目的条带。12 和 13 泳道分别是大肠埃希菌和金葡菌，未见目的条带，表明所设计的 PCR 引物的扩增结果特异性很高。M：100bpmark
8、er；17：O3:K6 型副溶血性弧菌；89：O4:K68 型副溶血性弧菌；1011:O1:K25 型副溶血性弧菌；12：大肠埃希菌；13：金黄色葡萄球菌图 1 细菌 tdh 基因片段的扩增（略）M：100bpmarker；17：O3:K6 型副溶血性弧菌；89：O4:K68 型副溶血性弧菌；1011:O1:K25 型副溶血性弧菌；12：大肠埃希菌；13：金黄色葡萄球菌图 2 细菌 toxRS/new 基因片段的扩增（略）22 多重 PCR 扩增（图 3）从图 3 可看出，111 泳道的 11 株流行群副溶血性弧菌均扩增出 360bp 左右的 tdh 基因片段和 850bp 左右的 toxRS
9、/new 基因片段，12 和 13 泳道的大肠埃希菌和金葡菌都未扩增出任何目的片段，表明此方法用于流行群副溶血性弧菌的快速鉴定特异性较高。M：100bpmarker；17：O3:K6 型副溶血性弧菌；89：O4:K68 型副溶血性弧菌；1011:O1:K25 型副溶血性弧菌；12：大肠埃希菌；13：金黄色葡萄球菌图 3 细菌 tdh 和 toxRS/new 基因片段的多重扩增（略）23 敏感性 PCR 在所作的稀释度中均很好的扩增出了目的条带，敏感性较高。3 讨论随着分子生物学技术的发展，用于副溶血性弧菌鉴定的分子生物学方法亦越来越多。当前用于副溶血性弧菌的鉴定方法就有随机引物 PCR6 （A
10、PPCR） 、实时 PCR7(real-timePCR)、脉冲场电泳8(PFGE)、基因芯片9等。APPCR 容易引起非特异性扩增，而实时 PCR、PFGE 和基因芯片方法技术含量高并且设备价格昂贵，因此，均不适于基层单位开展工作。由于当前的副溶血性弧菌食源性感染以流行群为主，并且可致病的多为含有耐热直接溶血素，因此，针对流行群特异的 toxRS/new 基因和耐热直接溶血素基因 tdh 设计引物建立副溶血性弧菌当前流行群的多重 PCR 快速检测方法。多重 PCR 并非单一引物对 PCR 的简单组合,在进行条件摸索时发现，Mg2+、dNTPs、酶的用量以及循环条件等均需进行优化,尤其是 DNA
11、 链退火温度。适当提高 Mg2、dNTPs 的浓度,能取得较好效果,酶的用量与单独扩增相似时，效果已很理想，量不宜过大，否则会出现拖带和非特异扩增。可见，该种群特异多重 PCR 方法简便、快速，同时特异性和敏感性也3良好，并且仪器试剂成本低，技术容易掌握，适合基层单位应用。【参考文献】1JaimeMartinez-Urtaza,AntonioLozano-Leon,AngeloDePaola,etal.Characterizationofpathogenicvibrioparahaemolyticusisolatesfromclinicalsourcesinspainandcomparison
12、withasianandnorthamericanpandemicisolatesJ.JClinMicrobio,2004,42(10):4672-4678.2NandiniRoyChowdhury,OColinStine,JGlennMorris,etal.NairassessmentofevolutionofpandemicvibrioparahaemolyticusbymultilocussequencetypingJ.JClinMicrobio,2004,42(3):1280-1282.3TracieLWilliams,StevenMMusser,JessicaLNordstrom,e
13、tal.IdentificationofaproteinbiomarkeruniquetothepandemicO3:K6cloneofvibrioparahaemolyticusJ.JClinMicrobio,2004,42(4):1657-1665.4Hin-ChungWong,Chih-HsuehLin.EvaluationoftypingofvibrioparahaemolyticusbythreePCRmethodsusingspecificprimersJ.JClinMicrobio,2001,39(12):4233-4240.5LeeCY,PanickerG,BejAK.Dete
14、ctionofpathogenicbacteriainshellfishusingmultiplexPCRfollowedbycovalinkNHmicrowellplatesandwichhybridezationJ.JMicrobiolMethods,2003,53(2):199-209.6MatsumotoC,OkudaJ,IshibashiM,etal.PandemicspreadofanO3:K6cloneofvibrioparahaemolyticusandemergenceofrelatedstrainsevidencedbyarbitrarilyprimedPCRandtoxR
15、SsequenceanalysesJ.JClinMicrobio,2000,38(2):578-585.7BlackstoneGM,NordstromJL,VickeryMC,etal.DetectionofpathogenicvibrioparathaemolyticusinoysterentichmentsbyrealtimePCRJ.JMicrobiolMethods,2003,53(2):149-155.8SJPeacock,GDIdeSilva,AJustice,etal.DayComparisonofmultilocussequencetypingandpulsed-fieldge
16、lelectrophoresisastoolsfortypingstaphylococcusaureusisolatesinamicroepidemiologicalsettingJ.JClinMicrobio,2002,40(10):3764-3770.9GoochJA,DepaolarA,KaysmerCA，etal.EvaluationoftwodirectplatingmethodsusingnonoradioactiveprobesforenumerationofvibrioparahaemolyticusinoystersJ.ApplandEnvironMicrobiol，2001,67(2):721-724.
