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1、,血清学诊断,禽流感、新城疫（HA、HI）,HA、HI依据标准,高致病性禽流感诊断技术 GB/T18936-2003 鸡新城疫检测技术规范 GB/T16550-1996,血凝原理,血凝抑制原理,血凝与血凝抑制试验基本原理,病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象，即为血凝 这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验,血凝试验（血凝效价的滴定),血凝试验结果判定,效价判定： 凝集特别显著：“” 凝集现象次之：“” 凝集清楚可见：“” 稍显凝集者：“” 血凝效价：呈“”凝集时的最高稀释度。此时的稀释度即为1个血凝单位。,结果判定,将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌 完全血凝(不流淌)
2、的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU) 终点稀释倍数除以4即为含 4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为 1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1/64(256除以4),思考,HA为什么加补充液 为什么选用4 HAU,血凝抑制试验,结果判定,测定孔：RBC沉于孔底中心，呈纽扣状 (+)、 凝集（-） 血清对照孔：RBC沉于孔底，无自凝 病毒对照孔：凝集 RBC对照孔：无自凝 血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制使的最高血清稀释度。,结果判定,只有阴性对照孔血清滴度不大于2 log2 ,阳性对照孔血清误差不超过 1个滴度，试验结果才有效。 HI价小于或等于3 log2判定
3、HI试验阴性;HI价等于4 log2为可疑，需重复试验;HI价大于或等于5 log2为阳性。,NDHI 的判读,注意事项 不同实验室结果可以不同 要有阳阴性对照 了解现场生产背景 临床解剖资料 免疫情况、采血周龄,应用,检测血清中的抗体水平。 鉴定病毒。 辅助诊断病毒性疾病。 作为适时免疫的辅助手段，能避免免疫失败、免疫空挡及重复免疫造成的损失。,禽流感免疫效果监测,弱毒疫苗的免疫效果判定商品代肉雏鸡第二次免疫14天后，进行免疫效果监测。鸡群免疫抗体转阳率50%判定为合格。 灭活疫苗的免疫效果判定家禽免疫后21天进行免疫效果监测。HI抗体效价24为免疫合格。 存栏禽群免疫抗体合格率必须70%判
4、定合格。,合理选择抗原：H9、H5、H7 H5:针对Re-1和Re-4株疫苗免疫采用相应抗原 同一亚型的禽流感病毒制成的抗原，如果毒株来源不同，则可能会存在抗原性差异，从而使检测同一血清的结果有差别 一般来讲，疫苗种毒株如果与抗原所用毒株相同时，则所测得的HI效价较高,禽流感HI应注意的问题,发病前后ND抗体的变化,NDHI与临床症状的关系,NDHI 4 感染100死亡 NDHI 4-7 感染发病90不死 NDHI 6-8 感染发病100%不死 NDHI 8-10 感染产蛋下降、 NDHI上升 NDHI 11-13 感染只见NDHI上升 NDHI 13-15 病毒无法侵入,HI试验注意事项,反
5、应试剂要按规定保存和使用。为避免反复冻融和细菌污染，可以无菌操作将试剂分装成小包装。 冻干的试剂应按照说明中规定的体积重新溶解并保存。 要避免杂菌污染，因为污染所造成的非流感起源的凝集素也可与所有抗血清发生非特异反应。,HI试验注意事项,反应温度不能太高，若在37 （如温箱）下进行，会影响检测结果。 标准抗原稀释液浓度必须为4个HA单位/25l，必须每天制备并在试验前滴定。 孵育时间要严格控制。红细胞对照完全沉淀时要迅速判读。在一些病毒株中可见红细胞从病毒中解脱，如果有这种情况的发生，要提前判定或4下孵育。,红细胞悬液要始终符合标准，使用时应随时振荡。 稀释液应选用PBS，反应体系为0.075
6、ml.,HI试验注意事项,影响HA和HI的因素,被检血清腐败变性。血样采集后要及时分离血清，分离后即时测定或放置在4冰箱内保存，不可过久，要力求新鲜。 缓冲液配制时间过长，pH值发生变化，使凝集不明显。缓冲液（PBS）尽可能现配现用，浓度和酸碱度要准确 病毒悬液和红细胞悬液在使用前没有摇匀，加入时浓度高低不一，人为造成误差。因此抗原和红细胞使用前一定要摇匀，保证每一孔中加入的浓度准确一致。,影响HA和HI的因素,配制红细胞悬液应采集2只以上成年公鸡的血 一般要求用非免疫公鸡，如果用免疫公鸡代替，但应增加洗涤次数和时间 在使用微量移液器时，每个吸头要安装牢固，防止漏气 移液器滴头不要离开液面，防止产生气泡，造成移液量不准 使用过和未使用过的加样头分开放,影响HA和HI的因素,微量血凝板的清洗，对试验结果有很大的影响。 使用过的凝集板，要按程序清洗干净。 清洗程序：试验完毕即将凝集板用自来水反复冲洗，再用洗涤剂的温水溶液浸泡30分钟，并在洗涤剂溶液中以棉拭子刷洗凹孔及板面，待反应板干燥后，放到23%浓度的盐酸中浸泡24小时以上，捞出用自来水冲洗多次，最后以蒸馏水冲洗23次，在37度温箱中烘干备用。,THANK YOU!,
