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1、一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量 TCID50 的操作步骤、计算方法及含义。二、测定病毒感染力的方法半数致死量 LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量 EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量 TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞 1 瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96 孔细胞培养板4、加样器、枪头5、
2、病毒液（PRV）四、TCID50 的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续 10 倍的稀释，从 10-1-10-10。2、将稀释好的病毒接种到 96 孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共 8 孔，每孔接种 100l。3、在每孔加入细胞悬液 100l，使细胞量达到 23105 个/ml。4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100l 生长液+100l 细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察 5-7 天。6、结果的计算，按 Reed-Muench 两氏法或 Karber 法五、TCID50 的计算方法1、Reed-Muench 两氏法 咱们一般情况下用这个计算病毒的TCID
3、?2、Karber 法含义：将该病毒稀释 103.875 接种 100l 可使 50%的细胞发生病变。操作步骤(1) 准备细胞 取出一块细胞培养板，每个孔大约传 800010000 个细胞（一个 T25 瓶的细胞消化后加 10ml 培养液正好传一块 96 孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约 60丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。细胞对照选取 16 个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。(2) 稀释待测病毒液。A 法为参考书上标准的操作方法B 法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要
4、胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。A 向每支试管中加入 1.8ml 病毒稀释液。向 1 号试管中加入 0.2ml 病毒，依次 10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。B 在 EP 管中用无血清的孵育液 10 倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-210-10 等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种 4 孔，则每个稀释度配 500l，即10-1 为 50l 加入 450l 的孵育液中；如每个稀释度接种 8 个孔，则各配制 1ml，即 10-1 为 100l 加入 900l 孵育液中。若接种 8 个孔，则相应增加液体量。上
5、述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种 8 个孔，若要统计分析则还要增加至 16 个孔。2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。2）此过程中需要使用加样器和 tip 头。使用前用 75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射 20min，确保无菌。使用新高压的 tip 头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去 96 孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到 96 孔板上，每孔 100l
6、，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复 4 次，计算标准差。】37CO2 培养箱中孵育 1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液 200l 继续在 37 CO2 培养箱中培养。(4) 培养将培养板放置于 CO2 培养箱。培养温度 ，培养 天。(5) 测定结果取出培养板，显微镜下观察细胞病变。计算方法1) Spearman-Karber 法LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + dR1/N1） X0 = 全部病变最低稀释度对数 d = 稀释因数对数N1 = 每个稀释度所种的孔数R1 = 病变孔数 = 积和 LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.72) Reed-Muench 法观察 CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50
