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1、临床病原体检测,云南省第一人民医院 毛小琴,教学目的要求,了解细菌耐药的产生机制 熟悉临床感染常见的病原体检测方法 掌握临床常见病原体的标本采集和运送,主要教学内容,感染的变迁及当前感染的情况 细菌的耐药性及耐药机理 临床关注的耐药菌的监测报 临床标本采集注意事项及细菌培养的报告制度,感染的变迁及当前感染的情况,疾病谱的变迁（G染色阳性菌为主G染色阴性菌为主） 新传染病的陆续出现（如：嗜肺军团菌，SARS冠状病毒） 一些已绝迹的老传染病死灰复燃（如：梅毒、结核等） 多重耐药株的出现 医院感染及条件致病菌感染的增加,一、临床常见病原体的检测方法,直接涂片显微镜检查（最简单、快速、直观） 病原微生
2、物的分离培养与鉴定（确诊方法） 病原体特异性抗原或抗体检测（如：沙门氏菌属的血清血清凝集、肥达试验等） 分子生物学方法（如：基因探针技术和PCR技术） 其他方法（如：动物接种和细胞培养法-主要用于病毒等）,二、细菌的耐药性及耐药机制,耐药菌株的现状 耐药机制（包括遗传机制和理化机制） 遗传机制 -固有耐药性（与生俱来） 生物基础是什么？（缺乏抗生素的作用位点；缺乏抗生素的转运机制；具有耐药基因；具有天然屏障） -获得性耐药（后天获得） 主要途径有哪些？（自身突变和基因交换）,理化机制（重点） -灭活酶或钝化酶的产生 -药物作用靶位的改变 -膜通透性改变 -主动外排作用 -存在抗生素抑制旁路 -
3、生物被膜的屏障作用 -缺乏药物的转运机制 -举例ESBLs,MRSA,Pae,表1 部分抗菌药物耐药的生化机制,三、常见耐药菌的监测,目的和意义 -指导临床用药，预测抗菌治疗的效果，更合理地选择抗生素。 -细菌耐药性监测和流行病学调查 -耐药机制研究的重要手段,直接目的,耐药性检测的方法 -纸片扩散法（定性检测） 如：最常用的KB法 -稀释法（定量检测） 如：琼脂稀释法、微量肉汤稀释法 -E-test法（定量检测） 此为结合稀释法和扩散法原理和特点而设计的一种简便、精确的测定MIC的方法。缺点：价格昂贵。,几个重要的概念 药物敏感性试验简称药敏试验，是指检测细菌对抗菌药物的敏感性（或耐药性）的
4、一种体外试验。 警告：体外试验结果与体内效果不一定一致。 MIC：最低抑菌浓度，即抑制细菌生长所需要的最低药物浓度。 MIC90：抑制90%试验菌株生长所需要的最低药物浓度。 MIC50：抑制50%试验菌株生长所需要的最低药物浓度。,敏感（susceptible,S) -指用常规剂量的抗菌药物在体内能够达到的浓度可以治愈细菌引起的感染，禁忌证除外。 中介（intermediate,I) -指抗菌药物对试验菌株的MIC值可接近血和组织中可达到的药物浓度，但抑菌速率低于敏感株。 耐药（resistant,R) -指允许的最大剂量的抗菌药物在组织或血液中的浓度仍达不到抑菌目的。,临床常见耐药菌的监测
5、 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的筛选测定 -是目前导致医院感染的重要病原菌 -定义和判读标准：,超广谱b-内酰胺酶（ESBL）检测 -目前只用于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌。 -判读方法及标准（按CLSI-2010执行） -ESBL阳性菌株的药敏结果处置 青霉素类、头孢菌素类和氨曲南都需报告为耐药，无论体外药敏结果是敏感还是耐药！,高水平氨基糖苷类药物耐药（HLAR）和万古霉素耐药肠球菌的筛选 -目的和意义：判断联合用药的可行性和效果 -测试药物：GN、链霉素、万古霉素（必须用稀释法测MIC值） -检测方法：纸片扩散法（临床实验室最常用）、稀释法（包括琼脂法和肉
6、汤法）、E-test法 -结果处置：若为耐药，则氨基糖苷类抗生素与作用于细胞壁合成药物（如：青霉素类和万古霉素）联合不出现协同。,耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）的筛选测定 -目的和意义：早期及时筛选出此类肺炎链球菌，指导临床合理用药。 -筛选方法：1ug苯唑青霉素纸片筛选 -判断方法：若抑菌圈20mm，则测试菌对青霉素G敏感；若抑菌圈19mm，则提示该菌对青霉素耐药或中度敏感，需用稀释法或E-test进一步测其MIC值。,四、临床标本采集和运送 （重点掌握）,血液标本 -采血时机:尽可能在应用抗菌药物前采集。最好的时机是预计寒战或体温骤升之前。（关键！） -采集标本数：建议采集两次，最好三次，
7、每次时间间隔大约1小时。 -血液量：成人10ml；儿童2-5ml；婴幼儿和新生儿最多能取1-2ml。 -每次取血后注入两个血培养瓶（即一个需氧瓶和一个厌氧瓶）。若没有血培养瓶，则置于含有抗凝剂聚茴香脑磺酸钠（SPS）的无菌瓶或试管中送检。,-皮肤消毒：静脉穿刺前必须对穿刺部位用杀菌剂仔细消毒（非常重要！），并需等待皮肤上的消毒剂完全挥发。可用2%碘酊、10%皮维碘、70%酒精、含0.5%氯已定的70%酒精。 注意事项： 必须一人一针！ 如果病人在输液，不能从输液管中抽血做血培养！而是尽可能从远离输血部位处抽血。 将血液用注射针刺入培养瓶前，必须先将培养瓶外盖取下后用消毒剂消毒瓶盖！注入后立即混
8、匀！ 如果一次抽血要做多项检查，必须先抽血培养的血（可直接注入血培养瓶）。 总原则：尽可能避免培养前标本污染！,脑脊液标本 -采集：由内科医生进行腰穿或脑室穿刺。 -采集量：成人2-5ml；儿童2-5ml；婴幼儿或新生儿1-2ml。 注意事项： 标本必须置于无菌试管中 标本需立即保温送检或床边接种,尿液标本 -无菌操作（需用带盖的无菌容器！） -培养用尿液需留中段尿 -采集前清洗外阴（尤其是女性和儿童！） 方法：先清洁手后用无菌纱布和温肥皂水从前到后清洗外阴。注意：不要用消毒剂！ -女性需避开月经期 -对于厌氧菌培养，采用膀胱穿刺法收集、无菌厌氧小瓶运送。 -尽快送检，最多不迢过1小时！,上呼
9、吸道标本 -理论上，标本采集应由专业医师或受过专门训练的人完成。 -方法：病人面对光源，用压舌板将舌下压，用无菌棉拭子用力擦拭两侧扁桃体、咽后壁和其他发炎的区域。 注意事项： 不能拭及舌和颊粘膜 最好用两个拭子擦拭同一区域，一个用于涂片检查，另一个用于微生物培养。,下呼吸道标本 -方法：采集前清洁口腔，再用力咳嗽、收集深部痰；也可由医生采集支气管灌洗液或支气管刷片送检。 注意事项： 标本需收集在无菌、带盖的容器（有商品化产品） 不要混入唾液！ 采样前清洁口腔 采集高质量的痰液标本，是一种技术！不容忽视！,泌尿生殖道标本 -尿道标本：将细径的棉拭子或无菌接种环伸入尿道3-4cm，轻轻旋转后取出，
10、脓性分泌物可直接收集在棉拭子或接种环上。 -肛门直肠标本：需将拭子伸入到肛门内4-5cm采集。 -前列腺液标本：按摩后取 -女性生殖道标本：都应在用窥器行盆腔检查时采集。按不同检查项目要求取相应标本（由专业医生取样）,粪便标本 -采集时间：最好在腹泻早期、病原体量大时、应用抗菌药物前采集。 注意事项： 应采集早晨的标本，以中午之前送至实验室（送检时间不迢过2h,否则用专用运送培养基送检）。 成形便为不合格标本 霍乱或其他弧菌检查用碱性蛋白胨水培养基送检 最好采集新鲜粪便为标本 标本最少5g，最好采集带血、粘液或脓液的部分，避免混有尿液。 选择带防漏盖的适当容器 当没有粪便排出但又必须检查或运送
11、所需时间较长时可采用直肠拭子标本,脓性渗出物、创伤和脓肿标本 -脓肿：用注射器和穿刺针尽可能多地抽吸脓液，无菌操作将脓液转入无菌容器中。如果没有无菌容器，可暂时保存在注射器中，盖上针帽送到实验室。（特殊部位，如眼部，可用棉拭子采集） -撕裂伤、贯通伤、术后创面、烧伤和褥疮溃疡的感染：目前尚无采集这些创面标本的标准程序，但应当遵循一些基本原则(选择脓腔表面、已失活组织、气体渗出部位或有其他异常征象部位,认真消毒后采集标本于无菌容器中送检）,-窦道和淋巴结引流液：如果有自发引流 征象时，引流物应用带有乳胶吸球的无菌 巴斯德吸管引流到无菌试管中；若没有明显的自发引流征象，外科医生可用无菌注射器、穿刺针和探针采集脓性分泌物；只有当没有无菌巴斯德吸管时，才可以用棉拭子。 -渗出物：需借外科操作抽取、放置在无菌容器送检。,
