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1、12，3 吲哚醌对人神经母细胞瘤 SHSY5Y 细胞增殖影响【摘要】 目的 研究 2,3 吲哚醌对人神经母细胞瘤 SHSY5Y 细胞增殖的影响。方法 应用 MTT 比色法观察 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞生长的抑制情况；流式细胞仪检测 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞周期分布的影响；Western blot方法观察其对细胞信号传导通路蛋白有丝分裂原激活的蛋白激酶（ERK）的作用，同时结合免疫细胞化学方法检测 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞 caspase3 的影响。结果 2,3 吲哚醌能显著抑制 SHSY5Y 细胞增殖，并使细胞周期阻滞于G0/G1 期；caspase3 蛋白
2、表达随着药物浓度的升高逐渐增加;加 2,3 吲哚醌后磷酸化的有丝分裂原激活的蛋白激酶蛋白(ERK1/2)相对表达量降低。结论 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞具有抗增殖作用，其作用可能是通过诱导细胞凋亡、改变细胞周期以及作用于细胞通路而实现的。 【关键词】 2 3 吲哚醌 细胞增殖 神经母细胞瘤 ABSTRACTObjectiveTo study the antiproliferation effects induced by 2,3dioxoindoline on SHSY5Y cells. Methods MTT method was used to examine the effec
3、ts of 2,3dioxoindoline on the proliferation of SHSY5Y cells, and flow cytometry to determine the cell cycle. Western blot was employed to assay the change of the key protein, ERK in the cell signal transmission way. The activity of caspase3 in the SHSY5Y cells was assayed by immunohistochemical tech
4、nology. Results2,3dioxoindoline was found to inhibit the proliferation of SHSY5Y cells, and disturb the distribution of cell cycle by increasing cell population in G0/G1 phase and decreasing in S phase. The expression of caspase3 protein was intensified and positively related to the dosage of 2,3dio
5、xoindoline. And the cell signal transmission way was also affected.Conclusion2,3dioxoindoline can inhibit the proliferation of SHSY5Y cells. The mechanism of its antiproliferation effects is possibly related to the change of cell cycle, the prevention of the signal transmission and the upregulation
6、of caspase3 protein in tumor cells. KEY WORDS2,3dioxoindoline ； cell proliferation； neuroblastoma 随着长春碱、长春新碱在临床上的应用，吲哚类化合物的抗肿瘤作用日益引起人们的关注1 。吲哚醌系天然存在于自然界的吲哚类化合物，是维持龙虾存活所必需的一种天然抗生长活性物质2,3 ，也存在于人体内及中药大青叶中。近年来的许多研究证实，吲哚醌对多种实体肿瘤细胞具有较强的杀伤和抑制作用4 ，但至今其单独作用于人神经母细胞瘤的报道少见。本研究观察 2,3 吲哚醌对人神经母细胞瘤 SHSY5Y 细胞株生长的抑制作
7、用，现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料及其来源 SHSY5Y 细胞株购自中国协和基础学院细胞中心。RPMI 1640 培养基购自Gibco 公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；四唑氮蓝（MTT）为 Sigma 公司生产；2,3 吲哚醌购自上海元吉化工有限公司，实验时使用 RPMI 1640 溶解并2过滤除菌。caspase3 一抗、SP 试剂盒，购自北京中杉生物技术有限公司。牛血清清蛋白（BSA）购自 Amresco 公司。兔抗人有丝分裂原激活的蛋白激酶(ERK) 抗体购自武汉博士德生物工程公司。过氧化物酶标记的驴抗兔抗体购自Amersham pharmacia biotech。
8、 1.2 方法 1.2.1 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞形态影响的观察 将对数生长期的SHSY5Y 细胞消化后，调整细胞浓度为 109/L，接种于培养瓶中。37 、体积分数 0.05 CO2 条件下孵育 36 h 后换新培养液，并加入 2,3 吲哚醌，使其终浓度分别为 0、100、200、400 mol/L，培养 48 h 后，倒置显微镜下观察细胞形态的变化。 1.2.2 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞的生长抑制作用检测 采用 MTT 比色法5 。取对数生长期的 SHSY5Y 细胞，调整细胞浓度为 108/L，接种于 96 孔板中，每孔细胞数 1104 个，接种 36 h 后换新
9、培养液，实验组加入 2,3 吲哚醌，使其终浓度分别为 50、100、200、400 mol/L，同时设立空白对照组（不加2,3 吲哚醌，加入等体积的 RPMI 1640 培养液） 。每孔体积为 200 L，每个浓度设 12 个复孔，分别培养 24、48、72 h 后，每孔加入新鲜配制的 MTT（10 g/L）10 L，继续培养 4 h 后，去除培养液，每孔加入 100 L DMSO 溶解结晶30 min，用自动酶标仪（Rayto 2100C 酶标仪）于 490 nm 处测定吸光度值。重复 3 次，取平均值，计算细胞生长抑制率。 1.2.3 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞周期影响的检测 取
10、铺满瓶底的SHSY5Y 细胞，去掉原液，加入新的细胞培养液准确调至 5 mL。24 h 后分别加入 0、100、200、400 mol/L 浓度 2,3 吲哚醌，作用 48 h 后收集细胞，调整细胞浓度为(0.51.0)109/L。将细胞悬液离心，弃上清，分别加入碘化丙啶（PI）作用 30 min，然后，用流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）进行细胞周期分析，每个样本分别约检测 11 000 个细胞，计算各期细胞数占细胞总数的百分率。 1.2.4 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞 caspase3 蛋白表达影响的检测 采用免疫细胞化学 SP 技术，取经 100、200、40
11、0 mol/L 2,3 吲哚醌诱导的SHSY5Y 细胞，以未经处理的细胞作为对照。分别用 40 g/L 多聚甲醛固定，按SP 试剂盒说明操作，其中 caspase3 一抗效价为 150。光学显微镜下观察并判断结果，细胞染色呈棕褐色或棕黄色为阳性。caspase3 蛋白定位于胞浆，也可见于胞核。连续观察 5 个高倍视野，计算阳性细胞百分率。 1.2.5 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞信号传导蛋白 ERK 的影响 取 4 瓶经0、100、200、400 mol/L 2,3 吲哚醌诱导的 SHSY5Y 细胞，细胞总蛋白的提取及 Western blot 检测参照文献6方法。35 g 的 SHS
12、Y5Y 细胞蛋白经SDSPAGE 电泳,转膜后置于含体积分数 0.01 牛血清清蛋白中封闭, 4 过夜, 加入一抗（抗 ERKs,即抗 p42 或 p44 有丝分裂原激活的蛋白激酶，1500 稀释） ，4 孵育 12 h ,TBS 清洗 , 再与二抗(过氧化物酶标记的驴抗兔抗体,11 000稀释)作用，置于摇床上孵育 4 h，TBS 清洗。化学发光剂室温作用 1 min，暗室中予 X 线曝光显影。采用 Kodak 图像分析系统对 X 线照片上的蛋白带进行扫描和半定量分析。 1.3 统计学处理 采用 SPSS 11.0 统计软件进行方差分析。 2 结 果 321 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y
13、细胞形态的影响 2,3 吲哚醌作用 48 h 后的 SHSY5Y 细胞失去正常的三角形，伪足消失，细胞变圆变小，贴壁细胞数目减少，部分脱落于培养液中，并且浓度越高，上述表现越明显，漂浮细胞越多。 22 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞生长抑制率的影响 2,3 吲哚醌能够抑制 SHSY5Y 细胞增殖，其作用具有剂量依赖性，差异有显著性。见图 1。 图 1 不同浓度 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞的生长抑制率比较 23 2,3 吲哚醌对细胞周期的影响 400 mol/L 组 2,3 吲哚醌处理 48 h 后 G0/G1 期（细胞静止期和 DNA 合成前期）比例高于其他 3 组，S 期和
14、G2/M 期低于其他 3 组，差异均有显著性（F=17.2948.01，q=7.1219.87，P0.05） ；200 mol/L 组的 3 项指标与其他 3 组比较，差异均有显著性（q3.0415.96，P0.05） 。见表 1。 2.4 2,3 吲哚醌对 SHSY5Y 细胞 caspase3 蛋白表达的影响 对照组、2,3 吲哚醌 100、200、400 mol/L 组 caspase3 蛋白阳性细胞数分别为（15.85.4）%、 （25.68.2）%、 （26.810.1）%、 （28.912.1）%，加药组 SHSY5Y 细胞中 caspase3 蛋白阳性细胞数较对照组明显增多，差异有
15、显著意义（F=25.65，q10.29，P 0.05） 。随着 2,3 吲哚醌剂量的增加，其表达量有明显增多的趋势。 2.5 2,3 吲哚醌作用后磷酸化的有丝分裂原激活的蛋白激酶蛋白（ERK1/2）相对表达情况 400 mol/L 不同浓度 2,3 吲哚醌组 ERK1/2 相对表达量分别为（81.435.42）%、 （79.946.23）%、 （79.019.12）%。 100、200、400 mol/L 2,3 吲哚醌组 ERK1/2 相对表达量较对照组降低，但是2,3 吲哚醌各组之间差别无统计学意义。表 1 不同浓度 2,3 吲哚醌组SHSY5Y 细胞周期分布比较 3 讨 论 近年来，吲哚
16、类化合物抗肿瘤作用正在引起人们越来越多的重视，尽管越来越多的吲哚类化合物被证明有抗肿瘤作用，但其抗肿瘤的机制尚未明了。本课题以人神经母细胞瘤 SHSY5Y 细胞作为目的细胞株，研究 2,3 吲哚醌对其生长的抑制作用，并初步探讨了 2,3 吲哚醌诱导凋亡的作用。结果显示，2,3吲哚醌能明显抑制 SHSY5Y 细胞增殖，并在一定浓度范围内（50400 mol/L）随其浓度增加而抑制作用明显增强，呈浓度依赖效应。 已有的研究证实，在细胞增殖周期中，G0/G1 期、S 期和 G2/M 期之间存在着影响细胞周期进行的调控点，而药物可能通过影响这些调控点来影响细胞的增殖，不同的药物可影响细胞周期的不同阶段7,8 。本研究检测了 2,3 吲
