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1、酶免疫组化技术,微生物与免疫学教研室,实验目的,1、掌握免疫组化技术的基本原理。 2、掌握检测T细胞表面分子CD3的实验原理及检测方法。 3、掌握SABC免疫放大技术原理。,免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique, IHCT）是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标记物，对抗原抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。 抗原抗体反应的特异性 组织化学的可见性,分类,酶免疫组化技术 荧光免疫组化技术 亲和免疫细胞组化技术 免疫金（银）细胞染色组化技术 免疫标记电镜技术 杂交免疫细胞组化技术,酶免疫组化技术,酶免疫组化技术是
2、直接以细胞或组织切片为抗原相，以酶联免疫技术检测抗原或抗体的存在与否或定位的一类酶免疫技术。 本实验以酶免疫组化技术检测CD3为例。以亲和素-生物素-过氧化物酶（ABC或SABC） 技术检测T淋巴细胞亚群为例验证酶免疫组织化学技术检测组织抗原的方法。,酶免疫组化染色中常用的酶及显示底物,最常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP） 常用的供氢体： 二氨基联苯胺（DAB）反应产物呈棕色 氨基乙基卡巴唑（AEC）反应产物呈橘红色 4-氯-1-萘酚反应产物呈灰蓝色,生物素-亲和素放大技术,是一种以生物素(biotin，B)和亲和素(avidin，AV)具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗
3、体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记，与标记免疫技术的有机结合，极大提高了分析测定的灵敏度。 特点：灵敏度、特异性、稳定性、适用性 常见类型：BAB法和ABC法,ABC法原理,1、预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生物结合，形成可溶的亲和素（或链霉亲和素）-生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）。 2、当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，ABC（或SABC）中未饱和的亲和素结合部位就可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应与ABC （或SABC）标记体系连成一体进行检测。,优点,一个亲和素（A）有4个生物素结合位
4、点，一个过氧化物酶可结合多个生物素分子，ABC法将亲和素作为“桥”把生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来，形成一个网络状复合物，其中网络了大量酶分子，因此应用于检测体系时，极大提高酶在抗原-抗体反应中的浓度，提高检测敏感性。,实验原理,将分离得到的淋巴细胞制成涂片，加入的CD3单克隆抗体与待检单个核细胞涂片作用。 CD3阳性的细胞就会与CD3单克隆抗体特异性结合，再用生物素化抗鼠IgG检测CD3单抗与待检细胞结合的情况。 最后加入链霉亲和素-生物素-过氧化物酶 (ABC桥联法)，与生物素化抗鼠IgG结合，酶遇到底物时，能催化底物产生有色不溶性产物。 根据细胞被底物着色的情况可以判定CD3阴性
5、和阳性的细胞，测定其阳性百分率。,间接ABC法：CD3鼠抗CD3单抗B-山羊抗鼠IgG抗体SABC,实验器材与试剂,1、5%BSA 2、抗CD3单克隆抗体 3、生物素化羊抗鼠IgG(二抗) 4、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SABC) 5、3,3,-二氨基联苯胺(DAB) 6、0.0lmol/L pH7.2PBS 7、淋巴细胞分离液 8、丙酮 9、玻片、吸水纸、显微镜等,实验步骤,1、无菌采集静脉血3ml/2人，注入盛有肝素的无菌试管中（肝素浓度为20U/ml全血），立即轻轻摇匀，使血液抗凝。 2、用无菌吸管加入等体积即3ml的室温PBS液，使血液等倍稀释。,3、取10ml试管2支，分别加入
6、1.5ml淋巴细胞分离液（Ficoll），将离心管倾斜45角，在距分层液界面上1cm处将稀释血液沿试管壁缓慢加至分层液上面，每管3ml，注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。,4、2000转/分离心30min，离心后另取1只10ml试管，加入6ml PBS液，用毛细吸管轻轻插到白膜层，取吸淋巴细胞层至此试管中，1500转/分离心10min洗涤2次。 5、第2次洗涤后弃去上清，用移液器将沉淀细胞和试管壁所剩PBS液（约200ul）混匀，吸取20ul细胞悬液于洁净载玻片上，制成涂片，自然干燥。,6、纯丙酮固定20min，双蒸水洗去多余丙酮，自然干燥。 7、在标本处滴加5%BSA封闭液50ul
7、，室温封闭10min，甩去多余液体，不洗。 8、滴加鼠抗人CD3单抗50ul，置湿盒中37作用1h。,固定的目的,使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构。 保存组织细胞抗原性 防止标本脱落 除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存 抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和后续组织制备中的细胞结构和成分的改变,9、PBS洗3次，每次2min，用吸水纸将细胞周围擦干。 10、加B-山羊抗小鼠IgG抗体50ul，置湿盒中37作用20min。 11、重复9。 12、加SABC 50ul，置湿盒中37作用20min。 13、重复9。,14、加DAB 50ul，室温1013分钟，双蒸水洗。（DAB需现配现用，即将A、B、C液各1滴加入1ml双蒸水中混合） 15、加苏木素染液复染30s。 16、加盖玻片镜检。,五、实验结果判定,阳性细胞染成棕黄色，阴性细胞为淡蓝紫色，计数100个细胞，并计算出阳性细胞百分率。 （流式参考：5672）,实验讨论,影响酶免疫组织化学技术的因素有哪些？ 能否用ELISA的酶底物进行免疫组化染色？为什么？ 除了用ABC法技术外，还有那些方法可用于检测T淋巴细胞亚群？,
