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1、HIV抗体检测技术,湖北省十堰市太和医院检验部,胡秀学,艾滋病诊断的特殊性,高度依赖实验室诊断 HIV检测的严肃性： 保证输血、器官移植的安全 错误结果将导致严重的法律问题 结果严格保密,艾滋病病毒的形态,HIV的逆转录酶缺乏35核酸外切酶活性 ，无法修复逆转录和复制过程中发生的错误 。,HIV颗粒,艾滋病病毒的结构,HIV生活周期,吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放,HIV-1通过gp120与靶细胞表面CD4分子和趋化因子受体结合,HIV感染后的血清学改变,诊断：确定个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。 监测：了解不同人群HIV感染
2、率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。 血液筛查：防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。,HIV抗体检测目的,筛查试验 初筛 复检 确证试验,HIV抗体检测程序,筛查试验,筛查试剂 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂，其中酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。 HIV抗体筛查样品 血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液。,筛查方法 酶联免疫吸附试验（ELISA） 化学发光或免疫荧光试验（CLIA）：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。 快速检测（RT）及其它检测试验 (1)明胶颗粒凝集
3、试验(PA) (2)斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验 (3)免疫层析试验,HIV抗体筛查试验,初筛试验 对呈阴性反应的样品，可出具HIV抗体阴性（-）报告；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。 复检试验 对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。 如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。 艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。,HIV抗体筛查检测流程图,(1)酶联免疫吸附试验（ELISA）,可使用血液、唾液、尿液样品
4、 单纯HIV抗体检测试剂 HIV抗原抗体联合检测试剂：同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。 HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。,四代艾滋病酶联免疫试剂比较,第四代,病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 Ab,IgM / IgG 抗体 HIV-1 / -2 / -O p24 抗原,病毒裂解液 重组抗原合成肽 HIV-1 / -2 / -O anti-p24 抗体,method,间接,间接,夹心,夹心,间接法检测抗体,双抗原夹心
5、法检测抗体,ELISA测定中的干扰因素,内源性干扰因素 外源性干扰因素,内源性干扰因素,类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子等,外源性干扰因素,溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全、反复冻融,操作中的注意事项,加样 温育 洗板 显色,标准化操作及流程,试剂准备、标本收集、测定方法和仪器操作写出正确的“标准操作程序”(SOP)，所有的实验技术人员在进行相关测定时，必须严格按相应的SOP进行操作。,ELISA法结果判断,临界值概念: 将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值 判断标准:标本OD值与临界值的比值大
6、于等于1(S/CO1)为阳性（对间接法及双抗原夹心法） 注意:不同厂家、不同方法临界值计算公式不同 cutoff=NC+0.1(0.15,0.12) cutoff=NC*2.1,酶联免疫吸附试验（ELISA）,优点：准确性高、价格低廉、判断结果标准客观、结果便于记录和保存 用途：流行病学监测及临床大量标本的检测,(2)化学发光或免疫荧光试验,采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。 HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。,（3）快速检测（RT）及其它检测
7、试验,优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在1030分钟内得出结果。 缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。,（1）明胶颗粒凝集试验（PA） 将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。,快速诊断试剂,PA法原理,（2）斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒） 以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上,加血清样品。 斑点EIA法用酶标记抗体，以后步骤同ELISA。 斑点免疫胶体金（或胶体硒）用红色的
8、胶体金（或胶体硒）A蛋白标记，用渗滤法作为洗涤方法。 阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10 min以内，使用抗原量少。,快速诊断试剂,金标诊断试验原理,快速诊断试验,（3）免疫层析试验(金标法、硒标法) 以硝酸纤维膜为载体。 加样区：预包被胶体金-抗原/胶体金-protein A结合物 测试区（T）：固定有重组HIV抗原， 质控区：抗HIV单克隆抗体/抗-protein A抗体,快速诊断试剂,全血样品 加50ul样品于样品垫中,手指血方法,静脉血方法,加一滴缓冲液,15分钟内读取结果,硒标法操作步骤,病人条,质控条,快速诊断试验,优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测
9、。不需专门设备和人员培训,一般可在1030分钟内得出结果。 缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。 注意：一定要将试剂平衡至室温,快速诊断试剂,HIV抗体确认试验,确认试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。 确认试验方法： 免疫印迹试验(WB) 条带免疫试验(LIATEK HIV) 放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA) 国内常用的确认试验方法是WB。,HIV抗体确认实验结果,WB确认HIV感染的判定标准和判定结果的基本原则,HIV-1抗体阳性：gp41和Gp120/gp160或加上gp41加上P24 阴性：无HIV抗体特异带出现。 可疑
10、：出现HIV抗体特异条带，但不足以判定阳性,HIV抗体确认试验不确定结果,P24 ：非特异性反应（孕妇，正常人） Gp160：非特异性反应，感染早期，感染晚期 Gp160，gp120：非特异性反应，感染早期，感染晚期 Gp160，p24：非特异性反应，感染早期，感染晚期,HIV抗体确认试验不确定结果,P24 ：非特异性反应（孕妇，正常人） Gp160：非特异性反应，感染早期，感染晚期 Gp160，gp120：非特异性反应，感染早期，感染晚期 Gp160，p24：非特异性反应，感染早期，感染晚期 Gp160，gp120，p24：感染早期，感染晚期 污染？,筛查试验阳性反应样品,HIV抗体确证检测
11、流程图,HIV抗体检测的要点 1、根据目的选择检测方法及检测策略。 2、严格遵守实验室SOP。 3、筛查试验阳性，须作确证实验。 4、筛查试验阴性，不应做确证实验。 5、筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。,HIV 抗体检测不能用来诊断 ： HIV 急性感染 新生儿HIV 感染,艾滋病病毒感染产妇所生儿童,阳性,阴性,用另一种不同原理或不同厂家 生产的筛查试剂再次检测,12个月进行HIV抗体筛查试验,确证试验,18个月时再进行HIV抗体筛查试验,报告HIV抗体检测结果阴性,艾滋病感染产妇所生儿童HIV抗体检测流程,阳性,阴性,阴性,阳性,用另一种不同原理或不同厂 家生产的筛查试剂再次检测,阴性,阴性,阳性,报告HIV抗体检测结果阳性,提供咨询，继续 随访，4周后再次 进行确证试验,不确定,阳性,婴幼儿HIV感染的抗体检测,适用范围： HIV感染产妇所生婴幼儿；已满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染的儿童。 婴儿应于12个月进行HIV抗体检测，结果阴性则排除感染，纳入正常儿童保健；阳性者继续追踪随访，至18个月再次进行HIV抗体检测，结果阴性排除感染。,谢谢！,
