临床微生物学检验课件

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1、临床微生物学检验,内容提要,第一节 标本采集与送检,一、血液标本采集 1.血培养的临床指征 患者出现以下一种或同时具备几种临床表现时可作为血培养的重要指征： （1）发热（38 ）或低温（36 ）； （2）寒战； （3）白细胞增多（10.0109/ L，特别是有“核左移”时）； （4）粒细胞减少（1.0 109/ L）； （5）血小板减少；,（6）皮肤、黏膜出血，常见于溶血性链球菌感染的菌血症，伤寒病人第410天可出现玫瑰疹，斑疹伤寒第46天可出现暗红色斑丘血疹； （7）昏迷； （8）多器官衰竭； （9）血压降低； （10）呼吸加快（呼吸率20/分或CO2分压32mmHg）；以及肝脾肿大；关节疼

2、痛；C反应蛋白、内毒素、降钙素原升高等。,2.血培养的标本采集时机 使用抗菌药物之前 含有抗菌药物吸附物的培养瓶 寒战前1小时 发烧前1小时 3.血培养的次数：双瓶双侧 4.血培养的采血量： 成年患者1015ml, 婴幼儿采血量5ml。,5. 血培养标本的采集 （1）皮肤消毒与防止血培养污染 （2）标本采集部位 从两侧上肢静脉采血，“双瓶双侧”采血培养。必要时从下肢静脉采血做第三套血培养。 （3）减少血培养污染的注意事项,6.血培养标本的运送 （1）采血后应该立即送检。如不能立即送检，需室温保存，切勿冷藏。 （2）标本接种到培养瓶后,需轻轻颠倒混匀以防血液凝固。 （3）血培养瓶在接种前、接种后

3、均不得冷藏或冷冻，否则会导致某些病原微生物死亡。 （4）接种后的培养瓶最好立即送到实验室，最迟不能超过2小时。 （5）自动化连续监测系统虽有允许延迟上机监测微生物生长的原理,还是应该尽量减少延迟上机时间，否则可能导致检测时间延长甚至假阴性结果。,二、尿液样本采集 1.送检指证 （1）有典型的尿路感染症状； （2）肉眼脓尿或血尿； （3）尿常规检查表现为白细胞和/或亚硝酸盐阳性； （4）不明原因的发热，无其它局部症状； （5）留置导尿管的病人出现发热； （6）膀胱排空功能受损； （7）泌尿系统疾病手术前。,2.标本采集方法 （1）清洁中段尿 （2）耻骨上膀胱穿刺 （3）直接导尿 （4）留置导尿管

4、收集尿液 （5）小儿收集包 （6）集尿法,3.采集容器要求 应由不与尿液成份发生反应的惰性材料制成；洁净、无菌、加盖、密封、防渗漏；不含防腐剂和抑菌剂；广口、具有较宽的底部、容积应大于50ml，盒盖易于开启。,4.标本运送 标本采集后应及时送检、及时接种，室温下保存时间不得超过2h（夏季保存时间应适当缩短或冷藏保存），4冷藏保存时间不得超过8小时，但应注意冷藏保存的标本不能用于淋病奈瑟菌培养。,5.标本采集注意事项 （1）通常取清晨第一次尿液送检。 （2）用药之前进行细菌培养。 （3）尿培养不得加防腐剂或消毒剂。 （4）本采集后应立即送检，否则可暂存于4冰箱。,1.送检指征 （1）急性腹泻：大

5、便次数明显增多，腹痛，里急后重，往往伴有发热，大便性状为粘液便或脓血便。 （2）慢性腹泻：大便次数多，多为稀便，伴有全身乏力等症状。 （3）无痛性大量水样便或米泔样稀便。 （4）先吐后泻：恶心、呕吐、腹痛、腹泻。有集体发病史，多为细菌性食物中毒所致。 （5）抗生素治疗后腹泻：常发生于长期抗生素治疗后，糊状便，排便次数增加。 （6）高热惊厥：通常为中毒性痢疾多见于婴幼儿和小儿。,三、粪便样本采集,2.标本采集与运送 （1）自然排便采集法 （2）直肠拭子法 3.注意事项 （1）合适的采样时机，疑似痢疾患者应在发病初期、使用抗菌药物前采取标本。 （2）送检：要采集新鲜标本立即送检。,四、下呼吸道标本

6、的采集（痰） 1.标本送检指征 （1）咳嗽、咳痰：痰液可为脓性、血性、铁锈色或红棕色胶胨样痰。 （2）咯血：肺结核病人常痰中带血； （3）呼吸困难； （4）发热； （5）胸痛：当炎症病变累及壁层胸膜时，会发生胸痛。,2.标本采集方法 （1）自然咳痰法 （2）支气管镜采集法 （3）胃内采痰法 （4）气管穿刺法 主要用于厌氧菌培养。 （5）小儿取痰法,3.注意事项 （1）晨痰为好。多数病人清晨痰较多，易于采集。且清晨痰含有的病理成分较多，会增加培养的阳性率。 （2）有1/41/2肺部感染患者可能发生菌血症，应同时作血培养。 （3）能在抗菌药物应用之前采集标本，标本采集后应立即送检，否则可暂存于4冰

7、箱。,五、上呼吸道标本（咽拭子） 1.标本送检指征 （1）病毒性普通感冒伴有明显咽痛时，怀疑为咽部链球菌感染，应做细菌培养。 （2）细菌性咽扁桃体炎：明显咽痛、畏寒、发热，体温可达39以上。 （3）上呼吸道感染易并发鼻窦炎、中耳炎、气管支气管炎，需送相应部位分泌物或痰液进行细菌培养。,2.标本的采集方法 3.标本采集注意事项 （1）采集时间：应于抗生素应用之前。时间上可无严格限制，但咽部是呼吸和食物的通路，也应晨起后采集为佳。 （2）送检：应立即送检。,六、脓液样本采集 1.送检指证 （1）局部症状：红、肿、热、痛和功能障碍是化脓性感染的五个特征，病变范围小或位置较深时，局部症状可不明显。 （

8、2）全身症状轻重不一：重者常有发热、头痛、全身不适、食欲减退等。一般均有白细胞升高、核左移、CRP升高、水肿等症状。严重者可发生感染性休克。 （3）软组织急性化脓性感染：疖、痈、蜂窝织炎、丹毒等。,（4）化脓性疾病：化脓性脑膜炎、化脓性骨髓炎、化脓性中耳炎、急性乳腺炎、急性阑尾炎等。 （5）脓肿：肝脓肿、肺脓肿、脓胸、腹腔脓肿、肾周脓肿、肛周脓肿、皮下脓肿等。 （6）创伤感染：外伤感染、术后刀口感染、导管感染、脐部感染、气管切开感染、深静脉置管感染。,2、标本采集与运送 （1）开放性脓肿和脓性分泌物 （2）大面积烧伤的创面分泌物 （3）封闭性脓肿,七、脑脊液标本采集 1.标本采集 由临床医师以

9、无菌要求做腰椎穿刺，抽取脑脊液23ml，盛于无菌容器中送检。脑膜炎奈瑟菌离体后能产生自溶酶，迅速自溶，肺炎链球菌及流感嗜血杆菌离体后也容易死亡。因此，脑脊液无论涂片或培养，必须于采集后立即送检。,2.标本拒收标准 （1）标本标识与化验申请单不符。 （2）标本未用无菌试管留取。 3.标本保存 采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置于室温，放置时间不应超过2小时，切勿放冰箱，否则影响检出率。,八、穿刺液标本采集 1.类型 胸水、腹水、盆腔积液、关节液等。 2.标本采集 采用无菌方法采集体内可疑感染部位的液体约2ml，注入无菌试管，或抽取穿刺液12mL注入多功能液体培养瓶，或抽取穿刺液25ml注

10、入血培养瓶，混匀，立即送检。如怀疑厌氧菌感染，应做床边接种或接种运送培养基。,3.标本拒收标准 （1）标本标识与化验申请单不符。 （2）标本不是无菌留取，容器不符合要求。 4.标本保存 采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置于室温，放置时间不应超过2小时。,二、不染色检查 1.悬滴法 2.湿片法 又称压片法。 3.毛细管法 主要用于检查厌氧菌的动力。,三、染色检查,1.革兰染色法 （1）初染 第一液初染剂（结晶紫）染色1分钟，水洗。 （2）媒染 第二液媒染剂（碘液）染色1分钟，水洗。 （3）脱色 第三液脱色剂（95%乙醇）1030秒，水洗。 （4）复染 第四液复染剂（稀释石炭酸复红或沙黄）

11、染色30秒，水洗，自然干燥后镜检。 （5）结果 油镜下观察，革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。,2.萋-尼抗酸染色法 （1）涂片加热固定后滴加一滴石炭酸复红液，用火焰微微加热至出现蒸汽，维持至少5分钟（可补充染液，勿使蒸发变干），水洗。 （2）用第二液盐酸乙醇脱色月1分钟，至涂片无色或淡红色为止，水洗。 （3）滴加第三液亚甲蓝复染液复染1分钟，水洗，自然干燥后镜检。 （4）结果：抗酸菌呈红色，背景及其它细菌呈蓝色。,3.墨汁荚膜染色法 （1）标本（脑脊液）离心沉淀涂片，标本与墨汁的比例以1：1或2：1，滴加一滴国产（质优）或印度墨汁混匀。 （2）小心放上盖玻片，勿产生气泡，轻轻按压以下后，镜

12、检。 （3）先在低倍镜下寻找有荚膜的细菌，然后用高倍镜或油镜确认。新型隐球菌可以见到宽厚透亮的荚膜，背景为黑色。,第三节 细菌的分离培养,一、培养基制备 培养基配制的基本过程 （1）配制溶液 （2）调节PH值 （3）过滤 （4）分装 （5）扎棉塞封口 （6）高压蒸汽灭菌处理,二、细菌的接种方法 （一）平板划线分离法 1.连续划线分离法 2.分区划线分离法 3.棋盘划线分离法,（二）倾注接种法 （三）穿刺接种法 （四）液体接种法 （五）斜面接种法 （六）涂布法 （七）自动接种法,三、细菌的培养方法 （一）需氧培养法 （二）CO2培养法 1. CO2培养箱法 2.烛缸法 3.化学法 4.气袋法,（

13、三）微需氧培养法 （四）厌氧培养法 1.庖肉培养基法 2.焦性没食子酸法 3.厌氧缸法 4.厌氧手套箱法 5.厌氧培养箱法,四、细菌的生长现象 （一）分离培养基上菌落的生长现象 1.观察菌落特征 2.血平板上的溶血现象：、溶血 3.气味,（二）细菌在液体培养基中的生长现象 1.肉汤培养基 混浊度（混浊、中等、微混、透明）、有无沉淀（粉状、颗粒状、絮状）、有无菌膜（膜状、环状、皱状），以及气味和色素等。细菌数量达106107CFUml，培养肉汤才见混浊。 2.血液培养的检查 应每天肉眼检查细菌生长情况，如溶血、产生气体或混浊度等，若为生长阳性应做进一步的分离鉴定和药敏，若为生长阴性，应孵至第7天

14、报告。,（三）细菌在半固体培养基中的生长现象 半固体培养基用于观察细菌的动力，有动力的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见有混浊或细菌生长的小菌落。,第四节 细菌数量测定,一、物理计数 1.计数器测定法 2.电子计数器计数法 3.比浊法 4.测定细胞重量法,第五节 细菌的生化反应,一、糖类代谢试验 1.糖（醇、苷）类发酵试验 （1）原理 不同细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖的能力各有不同，产生的代谢产物也随细菌种类而异。观察细菌能否分解各类单糖（葡萄糖等）、双糖（乳糖等）、多糖（ 淀粉等）和醇类（甘露醇）、糖苷（水杨苷等），是否产酸或产气。 （2）方法 将纯培养的细菌接种到

15、各种糖培养管中，放置一定条件下孵育后取出，观察结果。 （3）结果判断 若细菌能分解此种糖类产酸，则指示剂呈酸性变化；不此种糖类产酸，则培养基无变化 。才产气可使液体培养基中倒置的小管内出现气泡，或在半固体培养基内出现气泡或裂隙。,2.葡萄糖代谢类型O/F试验 （1）原理 又称氧化/发酵试验，观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧（氧化型），还是无氧降解（发酵型），或不分解葡萄糖（产碱型）。 （2）方法 从平板上或斜面上挑取少量细菌，同时穿刺接种于2支管，其中1支滴加无菌石蜡油覆盖液面0.30.5cm高度，经37培养48小时后，观察结果。 （3）结果判断 仅开放管产酸为氧化型，两管都产酸为发酵型

16、，两管均不变为产碱型。,3.半乳糖苷酶试验（ONPG试验） （1）原理 ONPG试验又称半乳糖苷酶试验。某些细菌具有半乳糖苷酶，可分解邻-硝基酚-D-半乳糖，生产黄色的邻-硝基酚。 （2）方法 取纯菌落用无菌盐水制成浓的菌悬液加入ONPG溶液0.25mL，35水浴，于20分钟和3小时观察结果。 （3）结果判断 通常在2030分钟内显色。出现黄色为阳性反应。,4.三糖铁试验（TSI试验） （1）原理 能发酵葡萄糖和乳糖的细菌产酸产气，使三糖铁的斜面均呈黄色，并有气泡产生；只能发酵葡萄糖，不发酵乳糖的细菌，使斜面呈红色，而底层橙黄色；有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生产硫化氢，硫化氢遇到铅或铁离子形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物；分解尿素，呈红色。 （2）挑取纯菌落接种于三糖铁琼脂上，经35培养1824小时。 （3）结果判断 出现黑色沉淀物为硫化氢阳性。,5.甲基红试验 （1）原理 某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为乳酸、甲酸、乙酸，使培养基的PH下降到4.5以下，