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1、细菌ESBL酶与耐药性,主讲人：华耀,细菌超广谱内酰胺酶与耐药性,1、什么是内酰胺类抗生素？ 2、什么是内酰胺酶？ 3、什么是超广谱内酰胺酶？ 4、它们与细菌耐药有什么关系？,？,一、内酰胺类抗生素,青霉素发现者、英国科学家弗莱明（1928）,（一）概念 -内酰胺类抗生素（-lactams）指化学结构中具有-内酰胺环的一大类抗生素。,(二) 内酰胺类抗生素抑制细菌的机理,N-乙酰葡萄糖胺 双糖十肽 转肽酶 N-乙酰胞壁酸五肽 聚合物 （PBPs）,粘肽（构成细胞壁）,内酰胺类抗生素,（）,胞浆内,细胞膜,细胞膜外,细胞壁合成受阻，细胞壁缺损，外环境水分渗入到菌体，菌体膨胀裂解而死。,二、内酰胺
2、酶,（一）概念 -内酰胺酶（-lactamase）是细菌产生的可水解-内酰胺类抗生素的酶。 绝大多数常见的-内酰胺酶有一个依赖丝氨酸发挥作用的机制。通常它们的活性位点具有一个狭窄的纵形沟状结构，在沟的底部形成了一个空腔（氧阴离子袋），这种疏松的构造容易弯曲，便于结合底物。,（二）、-内酰胺酶是细菌耐药的机理,丝氨酸的结构式,-内酰胺环上的羰基碳在结合内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，结果使其成为开环物。,（三）-内酰胺酶分类方法,一、Bush-M-J分类法（功能分类法） 根据-内酰胺酶的功能相似性（底物和抑制物的轮廓）分为1 ，2 ，3 ，4 四组，其中2组和3组又分为很多亚组。
3、二、Ambler分类法（分子分类法） 根据酶的氨基酸序列的保守性和相似性将-内酰胺酶分为A，B，C，D四组。,克拉维酸,三、超广谱- 内酰胺酶,（一）概念 超广谱- 内酰胺酶(extended spectrum beta - lactamases , ESBLs) 是由质粒介导的能赋予细菌对多种- 内酰胺类抗生素和单酰胺环类抗生素耐药并可被 -内酰胺酶抑制剂所抑制的一类 -内酰胺酶.,(二)超广谱- 内酰胺酶特点,（1）主要是有质粒介导 ESBLs 基因由质粒介导, 可通过接合、转化和转导等形式在细菌间扩散。,（2）产超广谱- 内酰胺酶主要是革兰氏阴性菌 如：大肠埃希菌属、肺炎克雷伯菌、奇异变
4、形杆菌 （3）能被- 内酰胺酶抑制剂所抑制 如：CA（克拉维酸）、甲氧西林,（1）TEM型 ESBLs,TEM 型 ESBLs 由 TEM- 1 衍化而来。在 TEM 家族中 TEM- 3 是第一个显示 ESBLs 特点的 TEM 型 - 内酰胺酶。TEM 型 ESBLs 的形成是因为238位甘氨酸突变为丝氨酸所形成的。这种突变提高了对头孢噻肟的水解能力。 2005 年发现的 TEM- 94发生了104,238 氨基酸位点的改变, 药敏实验证实其对头孢泊肟和头孢噻肟耐药。,（三）超广谱内酰胺酶类型,目前发现的超广谱 - 内 酰 胺 酶 种类已超过 200 多种, 其类型可以分为 TEM 型、S
5、HV 型、OXA 型、CTX- M 型、其它型等 5 类。其中 TEM和 SHV 型酶是临床上较常见的超广谱 - 内酰胺酶。,（2 ）SHV 型 ESBLs SHV 型 ESBLs 是由 SHV- 1 衍化而来。SHV 家族中第一个 SHV 型 ESBLs 是 SHV- 2。SHV- 2 发生了 Gly- 238- Ser 位点的突变, 这增加了对氧亚氨基类抗生素的亲和力和水解能力。 对比其它的 SHV 型 ESBLs 氨基酸序列分析发现, 氨基酸的突变主要集中在 179, 238, 240, 205 位点。,（三）ESBLs的检测方法 1、标准纸片扩散法,（1）表型初筛试验 按标准纸片扩散法
6、操作，当下述抗菌药物的抑菌环直径头孢泊肟(10g)17mm 或头孢他啶(30g)22mm 或氨曲南(30g)27mm 或头孢噻肟(30g)27mm或头孢曲松(30g)25mm时，提示为可疑产ESBLs菌株。,（2） 表型确证试验 使用头孢他啶(30g)和头孢他啶/克拉维酸(30/10g)及头孢噻肟(30g)和头孢噻肟/克拉维酸(30/10g) 两对药敏纸片，当两个药物中有任何一个在加克拉维酸后抑菌环直径与不加克拉维酸的抑菌环相比增大值5mm，可确认为产ESBLs菌株。,头孢他啶克拉维酸,头孢噻肟,头孢他啶,头孢噻肟克拉维酸,2 三相水解试验,区分菌株为产ESBLs或产头孢菌素酶（AmpC酶）
7、ESBLs和AmpC酶同时产生的情况。,号槽：酶粗提物；号槽：酶+CA；号槽：酶+氯唑西林（CLO）；号槽：酶+CA+CLO,单产 ESBLs 菌株,号槽：酶粗提物；号槽：酶+CA；号槽：酶+氯唑西林（CLO）；号槽：酶+CA+CLO,联合产 ESBLs 和 AmpC 菌株,3、E-test 法,E-test，为AB BIODISK公司开发的测试ESBLs的试剂条。应用表型确证试验的原理，将头孢他啶（或头孢噻肟）和复方制剂头孢他啶/克拉维酸（或头孢噻肟/克拉维酸）分别置于试条两端，将试条贴于接种了待测细菌的平板上，刻度面朝上，35培养18-24小时后，读取试条两端的MIC值。当头孢他啶与头孢他
8、啶/克拉维酸（或头孢噻肟与头孢噻肟/克拉维酸）的比值8时，即可判定为产ESBLs，否则为阴性。,4、分子生物学检测,聚合酶链式反应(PCR) 参照 GenBank 已发表的 TEM、SHV、CTX-M 和 OXA 各亚型的基因序列，分别设计特异性引物,5、总结ESBLs的检测方法,表型初筛试验,初步判断,表型确证试验,最终确认,三相水解试验,确认菌株是否只产ESBLs,E-test 法,分子生物学检测,（四）ESBLs 的防治,(1)开发能够相对或绝对能够抵抗内酰胺酶水解的新型抗菌药物。 (2)应用-内酰胺酶抑制剂 (3)规范抗生素的使用,（一）-内酰胺酶抑制剂,-内酰胺酶抑制剂是一种-内酰胺
9、类药物，可与-内酰胺酶发生牢固的结合而使酶失活，和其他抗生素联用可增强抗菌活性，减少其用量。,（二）-内酰胺酶抑制剂分类,按作用分为三类： （1）可逆性竞争性抑制剂：邻氯西林、双氯西林等 （2）不可逆竞争性抑制剂：克拉维酸、舒巴坦等 （3）非竞争性抑制剂：甲氧西林等,-内酰胺酶,-内酰胺类抗生素,-内酰胺酶,克拉维酸,不可逆竞争性抑制,药物分解，细菌存活,酶失活，药物起作用,-内酰胺酶,邻氯西林,+,邻氯西林,可逆性竞争性抑制,(三)合理使用抗生素,有报道显示抗生素尤其是第三代头孢菌素的应用与 ESBLs 的感染流行有关。 敏感菌因抗生素的选择性压力而被大量杀灭后，耐药菌得以大量繁殖而成为优势菌，同时抗生素的选择性压力也加快了细菌突变的速度。 因此合理使用抗生素并采取有效的消毒隔离措施，才是预防ESBLs 产生的最好方法。,谢谢大家，请指正！,
