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1、生物体内药物分析方法及应用,简介 2.体内药物分析方法设计与建立 3.方法学确认（评价、确证、考评）,1.1 生物样品分析是药代研究的必备手段：,分析化学是化学科学中的“眼睛” “眼睛”是心灵的“窗户” 透过“窗户”获得大量的信息,定量分析 定性分析（半定量）,1. 简 介,源于化学学科中的分析化学专业 具有分析化学的基本概念和要求 不同于一般的药物分析 同时具有生物学科的特点,生物样品中药物的分析测定是定量描述药物体内过程、 获得药代参数的重要手段之一。,1.2 方法学类型及特点： 体内药物分析方法大致可归为主要的五类： 1. 光谱分析法 2. 色谱法 3. 毛细管电泳法 4. 免疫分析法
2、5. 同位素法 （）,传统分类方法: 集各种方法之长, 为我所用: HPLC-UV HPLC MRD,体内药物分析方法特点： 灵敏度高： 受到给药剂量的限制 受到生物利用度的限制 浓度低: 专一性好： 生物内源性物质的干扰 体内新形成的代谢产物干扰 样品量少： 血液（血浆、血清、全血） 尿、胆汁、唾液、汗、乳汁、精液 粪便、组织器官,方法快捷： 不是专门的方法学研究， 利用方法较快的阐明药理学的问题。 可靠、重现性好： 药代实验的不可重复性。 药物类型多： 需要多种仪器、技术手段的配套,1. 2.1 光谱分析法 比色法 紫外分光光度法: 差示、导数、双波长、三波长 荧光分光光度法,1. 2.2
3、 色谱法: 分离效率高; 专一性较高 HPLC: 适用范围广; 室温检测; 样品预处理简单; 流动相选择范围广; 仪器自动化程度高 GC: 化合物气化；载气种类少； 方法灵敏，但受到进样量的限制 TLC: 检测条件受限制,1.2.3 毛细管电泳法: 分离效率高; 专一性较高 毛细管区带电泳 胶束电动毛细管色谱 毛细管凝胶电泳 毛细管等电聚焦 毛细管等速电泳 毛细管电色谱法,进样量少，检测条件受限制。,1.2.5 同位素法: 灵敏度高; 专一性差 放射强度表示标记药物量(eq.ng/ml) 同位素技术与其他分析法相结合以提高专一性,1.2.4 免疫分析法: 放射免疫分析 酶免疫分析 荧光免疫分析
4、,（二）、生物样本的药物测定方法 生物样品中的药物测定，免疫学和微生物学方法。应根据待测药物的性质，选择特异性好、灵敏度高的测定方法。色谱法包括高效液相色谱法（HPLC），气相色谱法（GC）和色谱-质谱联用法。在需要同时测定生物样品中多种化合物的情况下，LC-MS/MS和GC-MS/MS联用法在特异性、灵敏度和分析速度方面有更多的优势。应用放射性核素标记法测定血药浓度应配合色法，以保证良好的检测特异性。如某些药物难于用上述的检测方法，可选用免疫学或生物学方法，但要保证其可靠性。放射免疫法和酶标免疫法具有一定特异性，灵敏度高，但原药与其代谢产物或内源性物质常有交叉反应，需提供证据，说明其特异性。
5、生物学方法（如微生物法）常能反映药效学本质，但一般特异性较差，应尽可能用特异性高的方法（如色谱法）进行平行检查。,摘自: 临床前药代动力学研究技术指导原则（第二稿）（草案）,2. 体内药物分析方法设计与建立,2.1 体内药物分析方法设计的主要依据 2.1.1 明确分析方法设计的目的要求 a. 临床药物监护: 简便、快速、批量测定 b.药代动力学研究: 是否要求原形药物与代谢物同时测定 注意整个浓度变化的范围 样品量多, 方法尽可能简便,c. 配合新药设计合成、药理、毒理学的研究: 药物是否吸收? 生物利用度如何? T1/2? Tmax? Cmax? 化合物药代的快速评价 要求方法学简单，快捷的
6、提供实验数据。 d. 新药报批: 参照SFDA颁布的指导原则,按照SOP进行试验.,较快的获得信息,2.1.2 了解待测药物的特性, 调研文献 药物的结构、理化性质 检测方法? 溶解度? 稳定性? 药物的药理和毒理作用机制 生物样品:动物属性? 组织器官? (同一类化合物的)体内代谢情况 药物的剂量 给药途径 干扰成分的多少 样品的预处理方法,2.1.3 仪器设备与实验室条件 文献资料的可参考性? 可重复性? 别人可做的事情是否适合我们? 实验室硬件建设是否与研究课题相互匹配?,药物就是药物！它不是一般的化合物。 应掌握和理解它的药效和毒性作用机制、理化性质、将来的临床应用等等。 只有对其加深
7、理解才能进行深入的代谢研究，包括药物代谢研究所采用的方法技术。,2.2 体内药物分析方法设计与建立的一般步骤 总的原则：,3. 方法学确认（评价、确证、考评） （validation）,“生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究有别于其它药理毒理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。在通过特异性、灵敏度、精密度、准确度、稳定性等研究建立了检测方法学，得到了标准曲线后，在检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。”,摘自: 临床前药代动力
8、学研究技术指导原则（第二稿）（草案）,3.1 名词解释:,nominal concentration : 真实浓度 (浓度真值; 算术值) 如: 配置溶液(1.3mg/ml); 标曲或QC中的0.xng/ml fortified Samples : processed samples stock solution standard samples authentic samples: 与试验物质完全相同的样品 (或根据试验样品复制的标准品),3.2 体内药物分析方法的评价内容：,1. Selectivity: SFDA/FDA 2. Linear Range and Response Fact
9、or： S/F 3. Inter-Day Precision and Accuracy: S/F 4. Intra-Day Precision and Accuracy: S/F 5. Dilution Integrity: F 6. Sensitivity: S/F 7. Recovery (Extraction Efficiency) S/F 8. Matrix Effects: F 9. Carryover Evaluation F 10. Stability: S/F 11. Relative Retention: F,3.2.1 Selectivity:,被测组分与内源性物质、试剂中
10、杂质、代谢产物以及其它干扰物质有良好的分离; 必须证明所测定的物质是预期的分析物，内源性物质和其他代谢物不得干扰样品的测定。对于色谱法至少要考察6个不同来源空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图。对于质谱法则应着重考察分析过程中的介质效应。,1. 被试验药物标准样品的色谱图 2. 正常生物样品（空白）的色谱图 3. 空白生物样品外加被试药物的色谱图 4. 给药后的生物样品的色谱图,试验报告(论文)中应提供:,3.2.2 Linear Range and Response Factor：,必须用至少6个浓度建立标准曲线(n = / 5); 应使用与
11、待测样品相同的生物介质; 定量范围要能覆盖全部待测浓度; 不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。 建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点。,标准曲线 标准曲线线性范围 标准曲线的相关系数,试验报告(论文)中应提供:,5. 空白生物样品外加被试药物(低,中,高三个浓度; n5)经标准曲线的反算(back-calculated)测定浓度,标准曲线线性范围最低和最高浓度样品的色谱图,TabX. Standard Curve Readback Concentrations for XX 药物,3.2.3 Inter-Day Precision and Accuracy: 3.2.4 I
12、ntra-Day Precision and Accuracy:,Precision of the method, defined by the percent relative standard deviation ( %RSD = （standard deviation）（mean）100)， was determined from the interpolated QC sample concentrations.,Accuracy of the method, defined by the percent relative error ( %RE = （standard observe
13、d concentrationnominal concentration） （ nominal concentration ）100),Precision and Accuracy,Precision:,Accuracy,要求选择3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。 低浓度选择在定量下限（LLOQ）附近，其浓度在LLOQ的3倍以内； 高浓度接近于标准曲线的上限； 中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定5个样品，为获得批间精密度应至少连续测定3个分析批。 精密度用质控样品的批内和批间相对标准差（RSD）表示，RSD一般应小于15%，在LLOQ附近RSD应小于20%。 准确度一般应在
14、85%115%范围内，在LLOQ附近应在80%120%范围内。,若每日测定1次,连续测定5次，得日间结果,数据处理,3.2.5 Dilution Integrity:,如何测定超出线性范围的样品?,对大于200ng/ml的样品要进行稀释: 500ng/ml 50ng/ml,10X,所处理和测定的结果是否符合要求: 50ng/ml的可信限之内 (50 ng/ml ),对小于10ng/ml的样品如何处理: 10ng/ml 20ng/ml,x2,所处理和测定的结果是否符合要求: 10ng/ml的可信限之内 (10 ng/ml ),3.2.6 Sensitivity:,定量下限是标准曲线上的最低浓度点
15、，要求至少能满足测定35个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的1/101/20时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的80%120%范围内，RSD应小于20%。应由至少5个标准样品测试结果证明。,最低检测浓度(X/ml) 最低检测量(X) 最低定量下限(LLOQ),3.2.7 Recovery (Extraction Efficiency),提取回收率: 应考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应当一致、精密和可重现。,低、中、高(3个浓度):回收率不低于70%(原规定) 回收率不低于50%(改为),萃取回收率:,方法回收率:,低 中 高(3个浓度)的加入量与检出量的比较.,L. M. H.,Conc. 测定量 加入量 回收率 回收率 (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (%) (平均),1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15,L. M. H.,21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35,A B C,3.2.8 Matrix Effects:,在采用质谱方法进行体内药物定量检测时,应进行基质效应试验,观察基质对药物测定的影响.,基质（matrix） 尚无统一的解释，
