12.4 核移植技术与动物克隆1

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1、蛙: 1962年，未成功 鲤鱼: 1963年，中国科学家童第周早在1963年就通过将一只雄性鲤鱼DNA插入来自雌性鲤鱼的卵成功克隆了一只雌性鲤鱼，比多利羊的克隆早了33年。但由于相关论文是发表在一本中文科学期刊，并没有翻译成英文，所以并不为国际上所知晓。（源自：PBS) 绵羊: 1996年，多利（Dolly） 猕猴: 2000年1月，Tetra，雌性 猪: 2000年3月，5只苏格兰PPL小猪；8月，Xena，雌性 牛: 2001年，Alpha和Beta，雄性 猫: 2001年底，CopyCat（CC），雌性 小鼠: 2002年 兔: 2003年3-4月分别在法国和朝鲜独立地实现； 骡: 20

2、03年5月，爱达荷Gem，雄性；6月，犹他先锋，雄性 鹿: 2003年，Dewey 马: 2003年，Prometea，雌性 狗: 2005年，韩国首尔大学实验队，史纳比,早期动物克隆方法是采用胚胎分割，即用显微术将未着床的早期胚胎一分为二、一分为四或更多次地分割，然后分别移植给受体，妊娠产生多个遗传性状相同的后代的克隆方法，由此发育成的动物个体，属最简单的人工动物克隆方式。 随着对胚胎分割局限性认识及克隆技术的发展，人们开始研究核移植技术并取得成功，产生克隆动物的效率比分割技术大大提高，也就基本上替代了利用胚胎分割生产克隆动物的研究和开发。,12.4.1 动物克隆技术的原理和方法,12.4.

3、1.1 胚胎分割的原理,大多数哺乳动物，早期胚胎在不同程度上具有调节发育的能力，即去掉早期胚胎的一半，剩余部分可以调整其发育方向，仍可发育为一个完整的胚胎。反之，若把两个早期胚胎融合在一起，它们不是发育为两个连在一起的胚胎，而是在细胞间重新调整，仍发育为一个胚胎，即大多数哺乳动物的胚胎发育是调整发育。而且在早期胚胎的发育过程中，细胞分化的调整幅度很大，但随着发育的向前迈进，其调整能力逐渐减弱，细胞的组织发育方向变得愈来愈固定，直至调整能力完全丧失。,分割胚胎发育阶段与透明带的关系 胚胎发育早期，透明带及其完整是必要的。 胚胎分割的次数： 操作液：大多数研究都用含10%-20%血清PBS液。 动

4、物种类：动物种类不同，其胚胎的生物学特性就有所差别，不同动物胚胎分割时的难易程度也不同。 移植半胚数与移植部位：受体妊娠率随着半胚移植数的增加而提高。,12.4.1.2 胚胎分割的注意事项,12.4.1.3 细胞核移植的原理,细胞核移植技术（nuclear transfer）是目前最常用的动物克隆技术，是哺乳动物体细胞克隆的核心技术。它是利用显微操作仪将外源细胞的核移入去核卵母细胞中，经人工活化和体外培养后，再移植入代孕母体内，使其发育为含有与供体细胞相同的遗传物质的个体。,哺乳动物胚细胞核移植的原理是早期胚胎细胞具有全能性,它包含个体的全套遗传信息。 已分化的体细胞在特定的条件下经过去分化也

5、具有全能性.已分化细胞具有全能性的前提条件是这种细胞在体外进行诱导进入休眠状态.,12.4.1.4 细胞核移植技术的类型,1.胚胎细胞核移植： 将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞球，在电流的作用下，使单个细胞与去除染色体的未受精的成熟的卵母细胞融合，发育成胚胎后，移入受体妊娠产仔。 原则上一枚早期胚胎有多少个细胞，通过这种方法，就可以克隆出多少个个体。还可以细胞反复克隆出更多的胚胎，产生更多的克隆动物。,中国台湾省畜产试验所吴明哲研究员利用此法于1991年3月克隆出5头小猪。他用的就是细胞反复克隆法。如今经三次产仔实验，已经证明克隆个体也能繁殖后代。吴教授成功制成了九个胚胎，再将每一个胚胎复制

6、成4个共36个，分别移入3头母猪的卵巢中，怀孕5个月后产下8头小猪，死去2公1母，存活1公4母。他们认为：在性别的复制上，雄性难于雌性。 1990年5月，西北农大畜牧所张涌教授等人经过两年的时间 ，利用细胞核移植的方法，得到了世界上第一只克隆山羊。有人认为山羊胚胎的基因在两细胞时便被激活，由于时间太早，因而使得核移植比较困难。,1995年10月，在西北农业大学畜牧所窦忠英教授主持下，首批克隆了我国6只小猪。 1996年3月，中国农业科学院畜牧所朱裕鼎研究员主持克隆牛的实验成功。 1996年12月14日和21日，中国首批克隆小鼠在湖南医科大学诞生。 根据这些实践了解到：哺乳动物的胚胎细胞在分裂成

7、8细胞以前，所有的单卵裂球均为全能细胞，即每个卵裂球均能表达此个体的全部基因。 根据这一理论，以鼠为模型进行实验： 1）从昆明白鼠输卵管中取成熟卵母细胞，去其细胞核； 2）自L5黑鼠2-8个细胞的胚胎中取一单卵裂球，将注入去核卵母细胞；,3)将移核后的新胚胎移入昆明白鼠输卵中，孕育20天； 4）将此种胚胎移入母鼠子宫孕育； 12月14日，3只遗传特性为L5黑毛小鼠出生。12月21日，又有3只小鼠出生，不过其可一只呈褐色。这说明昆明白鼠卵母细胞质对黑鼠细胞核有一定的影响，它为进一步研究细胞核和细胞质的相互关系建立了一个很好的模型，具有重要的生物学意义。 2.胚胎干细胞核移植 将胚胎或胎儿的原始生

8、殖细胞经过抑制分化培养后，细胞数量增多，单细胞却不分化。因此，每个细胞仍然具有细胞全能性而发育成个体的能力，这样的细胞被称为胚胎干细胞系。从理论上讲，可以比胚胎核移植产生更多的动物个体。 目前仅有小鼠分离克隆出胚胎干细胞系并成功克隆出成体鼠。而牛、猪、羊、兔只分离胚胎干细胞系，却无成功个体产生。,3.胎儿成纤维细胞核移植 从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维(fibroblast)细胞，采用细胞核移植方法克隆出胚胎，要移植受体后，妊娠产仔，克隆出动物个体。1996年，英国报道选用此法克隆出3只山羊。 4.体细胞核移植 将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞

9、，克隆出胚胎，经移植至受体妊娠产仔，克隆出成体动物。1996年，英国的克隆羊”多莉”即用此法产生。具体克隆过程如下： 1）取处于后三分之一妊娠期的6岁母绵羊（芬兰多塞特白品种绵羊）的乳腺细胞作核供体细胞，用”饥饿法”使其进入休眠状态而使全部基因具有活性。,2）注射促性腺激素GN促使母羊（苏格兰黑面母绵羊）排卵， 28-33h取其未受精卵快速去核，放入10FCS（小牛血清）、1FCS和0.5FCS连续5天，饥饿使其进入G0期作为受体细胞。 3）乳腺细胞注射GN34-36h后与无核卵放入同一培养皿可，在微电流作用下乳腺细胞融入卵子，形成一个含有新遗传物质的卵母细胞。 4）将新的卵母细胞植入羊的结扎

10、的输卵管内，6天后发育成桑椹期胚胎或囊胚（8-16个细胞），再移入假孕母羊子宫内。 5）产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。 他们解快了两个重大的技术问题：一个是解快了使核供体细胞与核受体细胞（去核卵母细胞）同步的方法。二是解快了用体细胞做核供体与转基因的问题。,5.异种动物克隆 异种动物克隆在两栖类和鱼类上开展得比较深入，在哺乳类动物异种克隆的报道较少。 1999年，陈大元等对异种动物体细胞克隆应用在大熊猫，但由于难于找到合适的胚胎移植的受体，所以未能获得突破性的进展。,12.4.1.5 细胞核移植的技术路线,1.核供体的获得 在核移植操作中，细胞核供体首先必须是完整的二倍体。该细胞必须

11、持有该动物完整的基因组。其次，供体细胞核必须能在受体细胞的作用下，产生细胞分化过程的逆转。 目前的研究证明，核移植技术中核供体可以来源于不同的细胞，如胚胎细胞、胚胎干细胞、胎儿成纤维细胞及体细胞等。其中，以胚胎细胞克隆的应用最为普遍，体细胞克隆的意义最大。,对于早期胚胎细胞，先用0.2%链蛋白酶或PH2.5的酸性台氏液预处理，溶去胚胎透明带，然后将除去透明带的卵裂球放入Ca2+、Mg2+的培养液或含胰蛋白酶的培养液中短暂培养，使细胞间连接松散，再用吸管反复吹打即可得到单个卵裂球作为核供体，消化透明带的时间是影响卵裂球质量的重要因素。作用时间短，透明带不能充分消化，卵裂球不易获得，作用时间长，则

12、影响到卵质膜，容易破裂，在操作时容易失败。因此，分裂球应在解剖镜下监视透明带的消化过程，当透明带薄，膨胀适度时就应移出，再用适当口径的吸管吹打，使之分离。,对于体细胞，需建立稳定的细胞系，并处理诱离生长周期，进入G0期。从动物器官或组织分离出所需的组织团块，用动物组织培养的方法分离成细胞悬液，然后在含血清的培养液中培养，进行正常的传代，在传代时，每隔几代取一些细胞集落进行染色体分析，检查染色体是否为正常的整倍数，传代达到一定次数，细胞形态稳定，正常增殖，说明已建立了稳定的细胞系。取建系的细胞在含低浓度血清的培养液中培养1-5天。细胞在低营养培养液中可以被诱离生长周期，进入G0期。,2.受体细胞

13、的获得及其去核 作为胚胎细胞核移植的受体细胞主要有3类，即去核的成熟卵母细胞、受精卵及2细胞胚胎。大量实验证明，M期卵母细胞适用于所有的供体核，目前基本上采用去核的M期卵母细胞作为受体细胞质。因为核移植通常是用电融合的方法完成供体细胞与受体细胞的融合，所以在去核的同时要去掉第一极体，以免将其融合到卵母细胞内。而且在去核时应吸去尽可能少的细胞质和M期染色体。核受体细胞的去核可用化学处理和紫外光灭活染色体的办法，但以显微手术法简便有效。卵母细胞的去核方法主要有以下几种：,1）盲吸法 用微细胞玻璃管在第一极体下盲吸，吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。 2)功能性去核法 这是一种非

14、机械去核方法，通过用紫外线或激光照射使染色体失活而达到去核的目的。例如将卵母细胞经Hoechst33342染色和短时紫外线照射，可使核失去功能。 3）化学诱导去核 用脱羧秋水仙碱处理激活的小鼠减数分裂期卵母细胞，使其排放第二极体。由于脱羧秋水仙碱的作用，核染色质没有分开而全部进入第二极体，这样就可以完成去核。这种方法可以在同一时间大量去核，同时还避免了人为操作的不稳定性和重复性，这一方法应用将会使哺乳动物克隆技术大为简化。,3.细胞核移植 根据供体核移入部位的不同可分为带下移植和胞质内注射 1）带下移植：将核供体卵裂球放在操作液滴中，用一直径接近卵裂球大小的移植针吸取一枚分离出的完整卵裂球，注

15、入去核卵母细胞的卵周隙，并使供体细胞与卵质膜接触 2）胞质体注射：用注射针（内径58m）将细胞核直接注入卵质内，一般去核时留下的口进入。操作的环境温度在30-35左右，带下和胞质内注射后需进行激活处理。,4.细胞融合与激活 正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由卵母细胞胞质中母源信息所控制，成熟的卵母细胞质能使移人的细胞核在形态上和功能上发生改变。由于微吸管破坏了卵膜和一部分细胞质，同时移入的细胞核未与供体细胞质膜发生紧密联系，若直接移植，成功率很低，故需对重胚进行融合。重组胚的发育需要迸一步激活，卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精卵引起的卵母细胞激活还是人工的激活，都引起卵母细胞发生一系

16、列的反应，这些反应是胚胎发育所必需的，可以采用电激活和化学激活方法。激活的原理是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从减数分裂期中解放出来，并转到“受精”的状态。,5.重组胚的培养 重构胚需要在体外培养一段时间以观察其发育能力，方可移植到受体，兔和猪重构胚在体外培养24h以内即可，而羊和牛重构胚所需培养时间较长，一般发育到囊胚或桑椹胚时移植。 6 . 胚胎移植 重构胚的移植与胚胎移植的方法基本一样，将重构胚移入输卵管或子宫，以期产生克隆动物。输卵管移植一般适用于8细胞期胚胎。子宫内移植适用于桑椹胚到囊胚期阶段的胚胎，另外在胚胎移植时，应避免带入多余的培养液或气泡。 7.体细胞核移植后代的鉴定,里程碑式的突破,1996-1997年首只体细胞克隆动物“多莉”羊的成功证明了成熟的体细胞也具有全能性。,多莉培育者之一 伊斯维姆.穆特,世界首例兔体细胞克隆实验在2007年2月12日在我国获得成功 中国农科学院北京畜牧研究国家畜禽分子遗传育种中心博士后李善刚，日前成功获得来自胎儿成纤给细胞的克隆兔。分子生物学鉴定显示这是世界上首例存活的来自胎兔成纤给