基因芯片概述课件

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1、基因芯片 Gene Chip,什么是基因芯片？,基因芯片是干嘛的？,基因芯片是啥样的？,基因芯片咋做的？,基因芯片怎么分析的？,我零花钱较多，去哪买个完整基因芯片系统耍耍？,定义 基因芯片概述 原理 分类 基因芯片的应用 载体的准备 基因芯片的设计 基因探针的准备 点样及点样后处理 基因芯片图片获取及图像分析 配置基因芯片系统,1 基因芯片概述,随着人类基因组计划（HPG）的提前完成以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此

2、，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。人类基因组计划催生了基因芯片技术。基因芯片近年来又常被称为DNA微阵列（DNA Microarray）或DNA微阵列芯片。,1.1基因芯片的定义 基因芯片又称DNA芯片（DNA Chip）, 是指将大量特定的寡核苷酸探针分子有序地、高密地固定于支持物上，然后与进行了标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。 生物芯片起源于基因芯片。所谓生物芯片指高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子（如寡核苷酸、基因片段、cDNA或多肽、蛋白质）的微阵列，阵列中每个分子的序列及位置都

3、是已知的，并且是预先设定好的。,1.2 基因芯片的原理,基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列,据此可重组出靶核酸的序列。 大规模基因测序或多态性分析时，每个核苷酸或突变点都必须检测出来。因此，通常设计出一套大量的核苷酸探针，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点的碱基设计上有所不同，根据每套探针在每个位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱

4、基的种类。如果基因芯片仅是用于检测基因表达的差异，只需设计出针对基因中特定区域的几套寡聚核苷酸即可。,1.3 基因芯片的分类,由于基因芯片的制备方法和应用范围的不同，可以将基因芯片依据不同的标准分为不同的种类。 按载体材料区分：1）固定在聚合物膜（如尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的膜芯片。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2）固定在玻璃板上的玻璃芯片。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3）固定在硅板上的

5、硅芯片。4）固定在陶瓷表面的陶瓷芯片等。,按制作方法区分：原位合成芯片、直接点样法芯片等。 按载体上探针的种类区分：寡聚核苷酸芯片和cDNA芯片等。 按应用又可分为表达谱芯片和检测芯片。平常所说的基因表达谱芯片其实是从应用上讲，可用于对基因及其表达的量进行检测的芯片，寡聚核苷酸芯片和cDNA芯片都可用于表达谱研究，一般而言，基因表达谱芯片主要用于研究基因的功能，是指将待测及对照组的mRNA通过逆转录将荧光分别标记到两种组织的cDNA上，并与基因芯片进行杂交及荧光信号扫描，通过计算机处理就能确定芯片上的基因结合了探针的量，从而来判定此基因是否表达，或在两种组织中的表达是否有变化。,2 基因芯片的

6、应用,2.1 基因表达分析 基因芯片具有高度的敏感性和特异性，它可以监测细胞中几个至几千个mRNA拷贝的转录情况。与用单探针分析mRNA的点杂交技术不同，基因芯片表达探针阵列应用了大约20对寡核苷酸探针来监测每一个mRNA的转录情况。每对探针中，包含一个与所要监测的mRNA完全吻合和一个不完全吻合的探针，这两个探针的差别在于其中间位置的核苷酸不同。比如通过基因芯片绘出基因表达的时空图谱，有助于人类认识生命活动过程和特征；检测基因表达的差异；发现新基因以及进行大规模基因测序等。,Kanako等利用一个寡聚DNA芯片成功地对普通小麦在盐害逆境中的基因转录图谱进行了分析，最终得到的小麦的转录信息也具

7、有极高的可靠性。Girke等利用基因芯片研究了拟南芥种子发育过程中的基因表达。 Wang等利用5766个cDNA微阵列研究比较正常卵巢和肿瘤卵巢组织基因表达差异, 发现了几个和卵巢肿瘤进展相关的基因, 为卵巢癌的诊断和治疗提供了新的指导。,2.2 基因型、基因突变和多态性分析 在同一物种不同种群和个体之间，有着多种不同的基因型，而这种不同，往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较，就可以得出基因与性状的关系。但是，由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时决定的，因此分析起来就十分困难，然而基因芯片技术恰恰解决了这一问题，利用其可以同时反

8、应数千甚至更多个基因的特性，我们就可以分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。 Halushka等用高密度芯片检测75个非洲和北欧居民的28mb的基因序列, 结果获得了1480个等位基因, 对人类基因中的SNP性质、图像进行了系统全面的扫描, 并试图寻找基因与血压异常性疾病的关系。,2.3 疾病的诊断与治疗 人类的疾病与遗传基因密切相关，基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析，因此它在疾病的分子诊断中的优势是不言而喻的，是一种新的、强有力的分子工具。基因芯片技术已经被应用于感染性疾病、肿瘤、耐药菌株及耐药性的检测等方面的研究。 Hacia等利用96000种20mer的DNA芯片检测遗传性乳腺

9、癌和卵巢癌基因。在15例患者样品中，发现了14例存在着基因突变，检测准确率达到了99%，这也说明基因芯片技术能够快速准确扫描大量基因，适用于临床试验中的大量患者标本的检测。Falus等利用基因芯片技术来诊断地中海贫血患者体内-珠蛋白基因的突变，适用于大样本量患者的筛查，高自动化而且准确性极高，他们用红色荧光来标记探针，同时用红色荧光来标记靶基因，这样完全杂交的分子会产生黄色荧光信号，突变可通过分析两种荧光强度的对比度来区分。,2.4 药物研究中的应用 从经济效益来说，最大的应用领域可能是制药厂用来开发新药。所以已经有多家制药企业介入芯片的开发。如：Incyte Pharmaaceuticals

10、 Inc.，Sequana Therapeutics，Millenium Pharmaceuticals Inc.等。对于寻找新药来说，目标之一是应用芯片可以在基因水平上寻找药物靶标。 Gray 等把基因芯片药物设计和组合化学集成在一起, 针对鹅去氧胆酸28p的活性位点设计新的化学制剂, 检测了它们在基因组水平上对生物体的影响, 就得到了其二类结构。这足以说明，随着基因芯片技术的不断完善，在分子水平上进行药物研究必将达到一个新的高度。,探针设计 解决杂交条件一致性问题,芯片优化 提高芯片制备效率,公共 数据库,专用 数据库,确定目标 选择待检测的目标序列,数据分析 分析杂交检测结果及可靠性,基

11、因芯片 数据库,图像处理,数 据 库 查 询 序 列 分 析,生 物 信 息 学 数 据 挖 掘 数 据 可 视 化,杂交检测图像,基因芯片数据流图,3 基因芯片的设计,载体的准备 研究目标的确定 基因探针的准备 探针的选择和设计 参照体系的设计 点样及点样后处理,3.1 载体的准备 制备基因芯片，首先要选择一个合适的固相支持物-载体，以供基因能在上面进行杂交反应，一般的载体包括膜、玻片、塑料、陶瓷及硅等。 目前，经过化学修饰的玻片越来越成为人们青睐的对象，比如进行多聚赖氨酸修饰、APS氨基修饰、APS-PDC（异硫氰酸）修饰、APS-GA（戊二醛）修饰以及硫基修饰等，它具有其它载体所不能比拟

12、的诸多优点。 很多商业公司可提供修饰好可直接用于基因芯片点样的玻片：比如TeleChem公司、 Schott公司和FullMoon公司等。,DNA样品共价链接于载体上 可耐受高温、高离子强度 不可侵润性，提高退火质量 荧光信号本底低，背景干扰弱 可使用双杂交系统进行样本平行处理 点样密度非常高 表面平整，易于实现自动化 点样方便，成本较低,3.2 基因探针的准备 研究目标的确定 根据不同的实验目的，要设计不同类型的基因芯片，即表达谱芯片还是检测芯片。前者用于检测基因的表达状况，而后者主要用于检测特定基因的突变是否存在。表达谱芯片是目前最成功商业化的基因芯片，和检测芯片一样，表达谱芯片也是检测一

13、群特定的基因，但不同的是，表达谱芯片的检测对象是mRNA，即基因表达的产物。而且要应用双色荧光系统，表达谱芯片可以检测某个基因在两个样本中表达的差异。因此，研究者应当从自己的具体研究出发，设计出符合实验要求的基因芯片。, 探针的选择与设计 探针的设计是芯片设计中的核心，探针的特异性决定芯片杂交结果的特异性，同时根据不同的研究目的，探针在选择特异性区域和保守区域时应各有侧重点。另外，探针设计还与检测的灵敏度和稳定性密切相关。就探针的来源，目前比较常用的有cDNA探针和寡核苷酸探针。 cDNA探针就是与mRNA互补的DNA，由逆转录方法获得，一般被认为是真实表达的基因。完整cDNA的长度从几百个碱

14、基对到几千个碱基对之间，由于cDNA文库构建技术已经相当成熟，人们比较容易获得一个组织或个体大量种类的cDNA，这些从文库中扩增的得到的cDNA经纯化、检测、定量分析后溶解在适当的缓冲液中，可作为探针在点样法制备基因芯片时直接使用。,寡核苷酸探针是人工合成的，随意性好，设计创意的空间也大。设计寡核苷酸探针时，研究人员必须要对该基因有着充分的了解。是选择基因的保守区域还是特异性区域、是一段还是几段、是保留突变点还是另引入新的突变位点等，都要求实验人员根据自己的实际要求来考虑。一般来说，寡核苷酸探针既可以用于检测芯片的制备，也可用于表达谱芯片的制备。 长度一般选取在1570mer左右的片段，探针往

15、往在5端进行氨基修饰，考虑探针在杂交过程中的自由度，在探针的5端氨基后紧跟12个碳原子。探针的杂交区域应尽量避免存在二聚体结构。目前比较通用的DNA合成方法是亚磷酰胺三酯法，合成每个单核苷酸都需要四步以上的操作。美国安捷伦以及国内的赛百盛等公司都可提供寡核苷酸合成服务。当然，如果自己拥有一台DNA合成仪的话，就可以随时依照自己的意愿来合成目的寡核苷酸片段。, 参照体系的选择 一套合适的参照体系的运用，既保证了基因芯片质量的稳定性，又保证了其在不同实验条件下的可对比性。 阳性对照：一般选用管家基因，是指基因表达水平比较稳定，不太受环境变化而产生变化的一类基因，它能保证各种芯片杂交试验中基本都能保

16、证表达的稳定性，因而它们在各芯片上的信号应该保持一致，以它们作为校验标准，可以保证同一芯片上不同杂交样品间或不同芯片的杂交样品间表达信号的可对比性。 阴性对照：一般选用与所研究基因无同源性的其它种属的基因作为对照。 空白对照：一般选用不含任何基因的点样稀释液，空白对照可以作为分析芯片杂交结果时本底信号的参照。,3.3 点样及点样后处理 所谓点样，就是指利用点样仪将已经得到的探针序列通过接触式针点或非接触式喷点的方法点到预先进行过化学修饰的基因芯片载体上。 在基因芯片的制备过程中，对点完样的芯片进行后处理是其最后一道工序，也是其中非常关键的一道工序。点样后处理的目的主要是为了使探针能与载体表面牢固结合，同时，还对载体上未与探针结合的游离活性基团进行封闭以避免在杂交过程中非特异性的吸附对实验结果（特别是背景）造成大的影响。因此，基因芯片点样后处理的结果直接影响了实验结果的好坏。更高的探针固定率可提高杂交时的灵敏度；而封闭效果好的芯片在杂交