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1、,Chapter 15 遗传性疾病的分子诊断,There are many different techniques that can be used to diagnose the globin gene mutations, including gap-PCR, ARMS-PCR, and RE analysis of amplified product. globin：球蛋白,Key Points,Hemophilia is a congenital disease of the coagulation disorders which constitute recessive disor
2、ders linked to chromosome X. The study was carried out by the SSCP, RELP, Southern blot, VNTR, and STR. hemophilia：血友病； congenital disease ：先天性疾病； coagulation：凝固，凝结；recessive：隐性,Two multiplex PCRs are constructed in which 9 exons can be amplified simultaneously, and 98% of all deletions can be ident
3、ified. multiplex：多样化； exon：外显子； simultaneously：同时地； deletion：缺失,Phenylketonuria is an inborn error of metabolism resulting from a deficiency of phenylalanine hydroxylase. There are many techniques that can be used to mutation screening, such as PCR-STR, PCR-SSCP, PCR-RFLP, PCR-DGCE, and so on. Pheny
4、lketonuria：苯丙酮尿 phenylalanine hydroxylase：苯基丙氨酸羟化酶,Cystic fibrosis(CF) is caused by mutations in the CFTR gene. Five tests are most frequently used: resctriction enzyme analysis, the heteroduplex analysis, ARMS, reverse hybridization and OLA. Cystic fibrosis：囊胞性纤维症 heteroduplex：异源双链核酸分子 Hybridizatio
5、n：杂交,Huntingtons disease(HD) involves a polymorphic(CAG) repeat sequence located in exon 1 of the IT15 gene at 4p16.3. HD can be accurately confirmed or excluded by PCR-based assay. Huntingtons disease(HD) ：亨廷顿病,Fragile X disease results from trinucleotide (CGG) repeat expansions. At present, diagno
6、stic procedures of fragile X disease are based on Southern blotting and on PCR amplification. Fragile X disease ：脆性X综合征 trinucleotide：三核苷酸,Two major technologies are in use for PND and PGD: PCR for monogenic diseases and FISH for chromosomal aberrations. monogenic ：单基因的,遗传性疾病的分子诊断（molecular diagnosi
7、s of genetic disease）是指通过分析患者体内遗传物质结构或表达水平的变化，对人体健康状态和疾病做出或辅助诊断的方法。,评估基因的存在和缺陷通常以DNA为材料,评估基因的表达量则以基因转录或翻译RNA/蛋白质为对象,Section 1 遗传性疾病分子诊断的策略,所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突变有关。 基因突变的概念： 遗传物质的各种遗传性改变称基因突变（mutation），其实质是核苷酸的增添、缺失、替代、颠倒和转位。,自然条件 自发突变 人为干预 诱发突变 携带突变的生物个体或群体称为突变体（mutant） 对遗传性疾病的分子诊断有三种策略可供选择：1. 直接诊断策略；
8、2. 基因多态性连锁分析；3. 基因突变的定量,直接诊断策略,通过分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变。因此其前提是被测基因已经被克隆，其核酸序列和机构已被阐明。 点突变的诊断：即DNA分子中的一个碱基被另一个碱基所替换，其后果取决于替换的性质和位置,点突变背景清楚或部分清楚：allele specific oligonucleotide, ASO、PCR-ELISA、allele specific amplification, ASA、PCR-RFLP、基因芯片,点突变背景未知：single-strand conformational polymorphism, SSCP、de
9、naturing gradient gel electrophoresis, DGGE、heteroduplex analysis, HA、DNA序列测定、protein truncation test, PTT,片段性突变的检测：指DNA分子中较大范围的碱基发生突变 方法：Southern blotting、多重PCR,基因多态性连锁分析,间接诊断，在家系中进行连锁分析和关联分析 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）,第3代遗传标记,基因突变的定量诊断,Section 2 遗传病的分子诊断 血红蛋白病,血红蛋白病（hemoglobinopa
10、thy, Hb）是由于编码血红蛋白的基因异常而发生的一类遗传性贫血病。,主要分为两大类： 异常血红蛋白病，Hb发生结构上的异常，导致贫血病，例如镰刀状细胞贫血,地中海贫血，构成Hb的蛋白部分-珠蛋白的合成降低或消失，也称珠蛋白合成障碍性贫血,珠蛋白基因& 珠蛋白基因,镰刀状细胞贫血（sickle cell anemia） 镰刀状细胞贫血的分子机制 第一个成功在分子水平得以解释的人类疾病,镰刀状细胞贫血的分子诊断方法 最常用的是限制性内切酶法（RE）,地中海贫血（thalassemia） 由于珠蛋白基因缺失或突变导致某种珠蛋白链合成速率降低，造成链和非链合成不均衡，引起溶血性贫血。 按照合成速率
11、降低的珠蛋白类型分为、地中海贫血,-地中海贫血（ -thalassemia） 0地贫是链完全不能合成者 +地贫是部分链合成者 Hb Barts 水肿综合征 HbF为2 2 链减少形成 4聚体 HbH病 HbA为2 2 链减少,形成4聚体 具有较高的氧的亲合力，使组织供氧不足导致贫血,地中海贫血的分子机制,缺失型,+地贫 0地贫,1）+地贫：,左侧缺失：2基因,右侧缺失：2基因3端和1基因5端构成 融合基因,2) 0地贫,缺失珠蛋白到1基因5端缺25kb 只有基因缺17.4kb 和基因缺17.5kb 缺失2基因和1基因5端缺5.2kb,3）非缺失型地贫,中国人非缺失型HbH病 病因：2基因的12
12、5位密码子CTG（亮）突变CCG（脯),妨碍1 1二聚体的形成，导致贫血,分子诊断方法 PCR法、ARMS法、ASA法、SSCP法、等位基因特异性扩增技术（ASPCR）法,1）重型地中海贫血： 0/0 和0/+ 链合成减少，链合成增加，HbF对氧亲和力高，是组织缺氧 2）轻型地中海贫血： 0/A 和+/ A 3）地中海贫血：和基因缺失导致链、链不能合成,地中海贫血 是珠蛋白基因突变和部分缺失导致链合成速率降低。,地中海贫血的分子诊断方法 PCR-RDB法、PCR-ASO法、ASPCR法、突变寡核苷酸延伸扩增PCR（mutant oligonucleotide extention amplifi
13、cation, MOEA）法、多重等位基因特异PCR（multiplex allele specific PCR，MAS-PCR）法、基因芯片法,血友病（hemophilia）,多数凝血因子是蛋白质，由其有关的基因编码。由于这些基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表达降低或缺失即造成血友病,甲型血友病 概念：抗血友病球蛋白（antihemophilic globulin, AHG)遗传性缺乏所致 临床表现：出血不止 分子基础：F 由26个外显子（9kb）25个内含子（177kb）编码2351个氨基酸,分子诊断方法：基因倒位检测和非基因倒位检测 基因倒位检测：LD-PCR（长距离PCR） 非基因倒
14、位检测：PCR-RFLP法、VNTR法、STR法、PCR-SSCP法,乙型血友病 概念：凝血因子 即血浆凝血活成分（PTC ）遗传性缺乏 临床表现：出血部位：肌肉、关节、深部组织 分子基础：F，长度34kb，8个外显子和7个内含子以及侧翼顺序中调控区域构成,分子诊断方法：直接和间接方法检测 直接检测方法：直接测序法、基因芯片法和毛细管电泳 间接检测方法：RFLP法、SSCP法、DGGE法、双脱氧指纹图谱、变性高效液相色谱法,肌营养不良症（hemophilia）,主要有杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）和贝氏营养不良症（Becker muscul
15、ar dystrophy, BMD） 发病机制：抗肌萎缩蛋白基因的突变导致肌细胞膜上的抗肌萎缩蛋白发生结构和功能的改变所致,抗肌萎缩蛋白基因：DMD基因包括79个外显子和78个内含子，全长约2.3106bp，是目前已知人类最大的基因 分子诊断方法： 多重PCR技术,短串联重复序列（short tandem repeat, STR）连锁分析 定量PCR技术 RT-PCR技术,苯丙酮尿症（phenylketonuria, PKU）,主要是由于肝内苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase, PAH）严重缺失所致的苯丙氨酸代谢异常，为常染色体隐性遗传病 临床表现：智力障碍、色
16、素减少、尿特殊气味及神经和精神症状,分子诊断方法： PCR-STR连锁分析 PCR-RFLP 多重ASPCR法 PCR-DGGE法,囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）,由囊性纤维化穿膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR）基因突变所致 临床表现：极易发生呼吸道感染而引起气道梗阻及呼吸功能不全，多数患者仅能成活数年到10余年,分子诊断方法： PCR-SSCP法 HA法 ARMS法 反向杂交（reverse hybridization）结合酶联免疫法 OLA法 基因芯片法,亨廷顿病（Huntingtons disease, HD）,是一种有IT15基因上CAG重复序列异常扩展所致常染色体显性遗传的以舞蹈运动为主要特征的神经退行性疾病。 临床表现：进行性恶化的运动
