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1、中药指纹图谱 研究技术,中华中医药学会中药化学分会委员 周玉新,内 容,一、中药指纹图谱技术概述 二、中药指纹图谱研究指导原则 三、指纹图谱研究的相似度计算 四、中药指纹图谱的研究方法与思路 五、中药指纹图谱研究示例演示（实验）,一、中药指纹图谱技术概述,（一） 中药指纹图谱与中药质量 （二） 中药指纹图谱研究方法学 （三） 中药指纹图谱技术的发展,指 纹 图 谱,稳 定 性,可 控 性,安 全 性,有 效 性,1. 中药指纹图谱与中药安全、有效、稳定的关系,（一） 中药指纹图谱与中药质量,2. 国内中药质量评价现状,植物学方法： 原植物鉴定，显微鉴定等 植物化学方法： 理化鉴定 分析化学方法
2、： 仪器分析，色谱分析等 药理学方法： 生物鉴定法，生物等效等 分子生物学方法: DNA指纹鉴定,3. 国外植物药质量评价概况,标准制剂： 银杏 人参 西洋参 五味子 甘草 黄芪 贯叶连翘 定量测定结合主成分比例 固定产地以生产质量恒定制剂 多种分析手段和方法包括药材、中间体等指纹图谱,4. 中药指纹图谱的意义,是全面反应中药所含内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量，尤其在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量和稳定性 有利于中药及其产品进入国际市场,5. 中药指纹图谱建立的原则,系统性： 指纹图谱所反映的化学成分，应包括中药有效部位 所含大
3、部成分的种类，或指标成分的全部 特征性： 指纹图谱中反映的化学成分信息（具体 表现为保留 时间或位移值）是具有高度选择性的，是这些信息 的综合结果 稳定性： 指纹图谱在规定的方法与条件下应能作出相对一致 的指纹图谱 色谱特征的稳定性： 特征峰 特征区 特征参数 色谱条件稳定性： 不同仪器的验证 不同实验室的验证 不同操作者的验证, 品种鉴别-真伪 基源鉴别-产地 药用部位的鉴别-根、茎、叶、花、 果 提取工艺 药材炮制 限量成分的控制 一致性-不同批次的产品.,6. 指纹图谱研究目的,品种多、产地多;采收、加工不一致 化学组分与含量不同 （产品品质优劣不同） 有效组分种类繁多、含量相对少；非有
4、效组分成 分复杂、含量高 分析检测困难 （质量控制指标不统一） 基础研究薄弱 药材GAP建设滞后,7. 建立中药指纹谱所面临的问题,8. 对 策,加强GAP药材种植基地建设 加强中药种植与加工、炮制的规范化 加强中药化学成分的基础研究 应用现代分析技术手段进行中药指纹图谱研究,仪 器 设 备 技 术 人 员 研 究 经 验 系统性问题 稳定性问题 特征性问题,9. 中药指纹谱研究过程中面临的问题,色谱法 1. 液相色谱法（LC） 2. 气相色谱法（GC） 3. 薄层扫描法（TLC） 4. 毛细管电泳法（CE） 其它 1. 质谱法（MS）及色谱与质谱联用 2. X-衍射法 3. 近红外法（NIR
5、）等,（二） 中药指纹图谱研究方法学,（三） 中药指纹图谱技术的发展,应用范围 仪器设备与软件 指纹图谱标准,二、 中药指纹图谱研究指导原则,（一）目的和要求 （二）中药指纹图谱标准起草说明 （三）中药指纹图谱标准的建立,中药质量研究和质量标准的一个重要内容 加强中药质量管理、提高中药质量、保证药品安全、有效、稳定、可控 固定原料药（中药材）品种、产地和采收季节的前提下，需制定原料药(中药材)和注射剂的指纹图谱,（一）目的和要求,（二）中药指纹图谱标准起草说明,1. 名称、汉语拼音,2. 来源（产地、采收期、炮制）,按中药的命名原则制定,药 材：产地、采收期、炮制 中间体：提取工艺或提取物的来
6、源,3. 供试品溶液的制备 有效成分(专属性成分、指标性成分)的理化性投 质并结合检测方法的要求 提取工艺 参照物溶液的制备 对照品 内标物 标准提取物,中药指纹图谱检测方法的验证 （1）检测方法 测定方法、 仪器 、 试剂 、 测定条件 （2） 验证 专属性 （空白试验） 精密度试验（RSD3%） 重复性与重现性试验（S0.95） 稳定性试验（S0.95） 系统适应性试验 6. 指纹图谱的相关性,（三）中药指纹图谱标准的建立,注意事项 （1）所有成分应在2小时左右洗脱，并提供2小时的指纹图谱 （2）可建立各个组分的指纹图谱 （3）可建立多种方法的指纹图谱 （4）可选择典型样品的指纹图谱，或标
7、准提取物的指纹图谱， 或具有代表性的勾兑样品的指纹图谱作为标准指纹图谱,2. 指纹图谱标准的建立 （1）药材、中间体指纹图谱标准为企业内控标准，列入 起草说明 （2）10批供试品 （3）标准的规定：供试品的指纹图谱与对照提取物（标准提取物的指纹图谱一致；或供试品的指纹图谱与对照指纹图谱（标准图谱）一致；或通过对各特征峰的位置（相对保留时间、比移值等）、丰度（积分面积或峰高）及相对丰度、光谱特性（颜色）等综合参数的描述予以确定。,指纹图谱标准书写格式,液相色谱法 【指纹图谱】 照高效液色谱法（中国药典一部附录VI D），结合指纹图谱的要求测定。 色谱条件及系统适用性试验 如以对照品做系统适用性试
8、验，则参照中国药典书写格式。如以随行对照提取物做系统适用性试验，则只书写所用仪器、色谱柱型号及有关参数和各项具体试验条件。 对照品溶液的制备 如有对照品则照中国药典书写格式。 供试品溶液的制备 精密吸取供试品溶液、对照品溶液（或对照用提取物溶液）各 XX ml，分别流入液相色谱仪，测定。 本品指纹图谱的主要特征 供试品指纹图谱与质量标准所附的对照指纹图谱（或随行对照提取物指纹图谱）经计算软件计算，相似度大于 XX，符合要求（或相似度小于 XX，不符合要求）。,三、指纹图谱研究的相似度计算,（一）、指纹图谱相似度评价原则与方法 （二）、指纹图谱相似度计算原理 （三）、指纹图谱相似度评价软件,（一
9、）、指纹图谱相似度评价原则与方法,原则： 整体性、模糊性、特征性 方法： 直接观察、计算机辅助相似性计算,1. 引用参数 2. 数据获取途径 3. 相似度算法,（二）、指纹图谱相似度计算原理,1. 引 用 参 数, 保留时间(RT) 峰高(Height) 峰面积(Area) 峰面积百分比（Area%） 相对保留时间（Ratio of Retention Time, RRt） 积分相对比值（Ratio of Area, RA）,2. 数 据 获 取 途 径,（1）图形/图像转化成ASCII数据 （2）截片数据 （3）色谱数据,3. 相 似 度 算 法,夹角余弦算法,相关系数算法,优 化 算 法,
10、1. 软件开发原则 2. 市售/常用软件简介 3. 相似度软件使用过程中应注意的问题,（三）、指纹图谱相似度评价软件,1. 软 件 开 发 原 则,系统独立性 (2) 计算方法的科学性 (3) 数据接口通用性 (4) 操作过程及应用的实用性,2. 市售/常用软件简介,浙江大学 陈一宇教授 中南大学 梁逸增教授 沈阳药科大学 毕开顺教授 西北大学 李华教授 二军大 Waters,3. 相似度软件使用过程中应注意的问题,数据接口与数据类型 数据的校正 算法的选择,四、中药指纹图谱的研究方法与思路,（一）、研究方案设计 （二）、样品的选择与收集 （三）、供试品的制备 （四）、指纹图谱色谱条件研究的思
11、路 （五）、相似度值的研究与指纹特征,（一）、研究方案设计,资料收集与整理 文献、工艺资料、质量标准 方案的设计 （1）研究对象-有效成分 （2）研究方法的选择-色谱法(HPLC GC TLC)及其它方法 （3）研究内容-根据技术要求的规定：包括“名称、来源、制备、检测方法、标准规定及起草说明”,（二）、样品的选择与收集,要求： 10个批次 道地药材与GAP基地药材 典型性与代表性 离散样品的剔除,（三）、供试品的制备,依据： 有效组分的物理化学性质 生产或提取工艺 检测方法的需要,（四）、指纹图谱色谱条件研究的思路,高效液相色谱法 HPLC 气相色谱法 GC,（1） 检测波长的选择 （简）
12、（2） 柱温的选择 （略） （3） 进样量 （简） （4） 色谱柱的选择 （重点） （5） 检测成分的选择 （重点） （6） 流动相（梯度表）的选择 （重点）,1. 高 效 液 相 色 谱 法 HPLC,示例：蜂胶(Bee Propolis),（1） 检测波长的选择,=280nm,=360nm,=254nm,=210nm,波长选择：=280nm,（4） 色谱柱的选择,选用市场上较常见的填料所填充的色谱柱，例如：Eka-Nobel的Kromasi C18 (5mm)，其分离效果好、性能稳定，无论是国产填充的Kromasi色谱柱，还是国外公司填充的Kromasi色谱柱，在分离效果上基本相同。因此对
13、于大多数中药注射剂，可选用Kromasi色谱柱。 如选用乙腈-缓冲溶液，应根据缓冲溶液的特点，选用相应的色谱柱： 如为酸性缓冲溶液，可选用Zorbax SB-C18色谱柱（pH6）。 示例：不同的色谱柱对三七总皂苷的分离效果,Lichosorb,Polaris,Kromasil,Diamonsil,Carbosorb,（5） 检测成分的选择 （重点）,示例：何首乌,何首乌生品的液相色谱图（全局图）,何首乌生品的液相色谱图（局部放大图）,图9 上海制首乌指纹图谱,北京良方药业制首乌,北京金象药店制首乌,北京寿春堂药店制首乌指纹图谱,（6） 流动相（梯度表）的选择,主要影响因素 1. 起始浓度 2
14、. 梯度速率 3. 流速,* 为体积百分比（V/V）,指纹图谱流动相梯度优化,* 为体积百分比（V/V）,梯 度 表,初始色谱条件,初始色谱条件的设定依据及目的,依据：化合物极性大小。如未知时，假设有效组分中包含各种极性的成分。 目的：快速确定主要或大部分化合物被洗脱时流动相的组成，为优化条件的选择提供依据。,优化条件的选择,选择依据：初始色谱图、梯度洗脱表及一定的经验 示 例：（1）淫羊藿总黄酮（40%）提取物 （2）钩藤总生物碱 （3）黄连药材 （4）知母总皂苷,淫羊藿提取物在初始条件下的色谱图,淫羊藿提取物第一次优化后的色谱图,梯度速率： 初始：100/60min=1.7 /min 优化
15、：01.7,CH3CN%,CH3CN%,Min,Min,初始条件,CH3CN%,Min,三七 人参 西洋参,CH3CN%,Min,起始浓度： 根据初始色谱图中主要色谱峰被 洗脱时的流动相组成，相应减少 20%。 流 速： 0.52.0 ml/min,2. 气 相 色 谱 法,（1）影响色谱峰分离程度的因素 色谱柱的类型 载气流速 起始柱温 升温速率,（2）研究示例 样品：广藿香油指纹图谱研究过程,方案设计,检测方法 （1）色谱方法 广藿香油为广藿香药材经水蒸汽蒸馏而得到的挥发油，均为易挥发组分，拟采用气相色谱法（GC）。 （2）仪器： Agilent 6890 GC （3）色谱柱的选择 可供选择的色谱柱：极性 非极性 中等极性 （4）进样方式的确定 手动 自动 顶空,2. 供试品溶液的制备 取广藿香油适量，加醋酸乙酯溶解，即得。,注：对于非极性毛细管色谱柱，如供试品溶液中含少量的少，最好干燥后进样。,2. 色谱条件的摸索 （1）对梯度速率及流速进行微调-由粗到精,初始条件 流 速： 3.0 ml/min 进样口温度： 250 检测口温度： 280 初 始 柱 温： 50 升温 速 率： 30 /min,第一次优化 流 速： 2.0 ml/min 进样口温度： 250 检测
