遗传病诊断课件

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1、遗传病的诊断,遗传病的诊断（diagnosis of hereditary disease）指根据患者的临床症状、体征及辅助检查结果并结合遗传学分析，判定是否患有某种遗传病及遗传方式。,遗传病的诊断,概念,方法,临床上遗传学诊断方法包括：临床诊断、症状前诊断（presymptomatic diagnosis）、产前诊断和植入前诊断（preimplantation diagnosis）。,遗传病的诊断,第一节 遗传病的临床诊断 第二节 细胞遗传学检查 第三节 生化检查 第四节 产前诊断 第五节 基因诊断,第一节 遗传病的临床诊断,一、临床诊断的概念 临床诊断（symptomatic diagno

2、sis）是指结合遗传咨询对患者的病史、症状、体征和实验室检查结果进行综合分析，确定诊断并判断遗传方式。,二、临床诊断的内容 1.病史 除应了解一般病史外，还应着重采集与遗传病家族聚集现象有关的以下项目： 家族史：整个家系患同种疾病的病史，能充分反映患者父系和母系各家族成员发病情况。 婚姻史：结婚的年龄、次数、配偶的健康状况及是否为近亲婚配。 生育史：生育年龄、子女数及其健康状况，有无流产、死产、早产史、畸胎等。,二、临床诊断的内容 2症状与体征：关注智力、五官、四肢发育、第二性征。,二、临床诊断的内容,3.家系分析 系谱分析是单基因遗传病不可或缺的遗传分析方式。 （1）系谱的系统性、完整性和可

3、靠性。 （2）部分显性遗传病具有延迟显性、外显不全和不规则显性的特点。 （3）新的基因突变、遗传异质性对系谱分析的影响。,第一节 遗传病的临床诊断 第二节 细胞遗传学检查 第三节 生化检查 第四节 产前诊断 第五节 基因诊断,第二节 细胞遗传学检查,核型分析：确诊染色体病的主要方法。确认更多的染色体数目和结构异常综合征。 标本的来源：外周血、羊水中胎儿脱落细胞和胎儿脐带血，以及受检者的各种病理组织等。,一、染色体检查,染色体检查指征： （1）明显智力发育不全者； （2）先天畸形、生长迟缓者； （3）夫妇之一有染色体异常，如平衡易位、嵌合体、结构重排等携带者； （4）有反复多次早期流产史的妇女及

4、其丈夫； （5）原发闭经和女性不孕症； （6）两性内外生殖畸形者； （7）无精子症和男性不育症； （8）家族中已有染色体异常或先天畸形的个体； （9）35岁以上高龄孕妇,二、性染色体检查,X染色质检查：X染色质数目=X染色体数目-1。 Y染色质检查：Y小体数目等于Y染色体数目，,取材：患者口腔粘膜脱落上皮细胞； 产前诊断：取羊水中胎儿上皮细胞涂片。,类型 X染色质数目 Y染色质数目,正常男性（XY） 0 1 正常女性（XX） 1 0 Turn综合征 （XO） 0 0 Klinefelter综合征 （XXY） 1 1 XYY综合征 0 2 XXX综合征 2 0,三、荧光原位杂交技术（FISH）检

5、查,检测染色体微小结构异常： 缺失、插入、易位等和DNA的基因定位。,优点： 快速、安全 灵敏度高 特异性强。,不足： 只能用已知的特异性探针检测染色体异常。对于一些复杂的、微小的结构异常，需要结合常规细胞遗传学检查使诊断结果更加准确。,18三体综合征患者的FISH检测,第一节 遗传病的临床诊断 第二节 细胞遗传学检查 第三节 生化检查 第四节 产前诊断 第五节 基因诊断,第三节 生化检查,一、蛋白质和酶的检测,1. 常见遗传代谢病的酶活性检测,假肥大型肌营养不良症（DMD）患者血清： 磷酸肌酸激酶活性升高。,一、蛋白质和酶的检测,2. 材料来源,第三节 生化检查,苯丙酮尿症（PKU）患者：

6、检测血清中苯丙氨酸或尿中苯丙酮酸、苯乙酸。,二、代谢产物的检测,三、生化检查在临床诊断中的应用,苯丙酮尿症,典型PKU是由于患儿肝细胞缺乏苯丙氨酸-4-羟化酶（PAH），不能将苯丙氨酸转化为酪氨酸，在其合成和再生途径中必须经过鸟苷三磷酸环化水合酶（GTP-CH）、6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶（6-PTS）和二氢生物蝶呤还原酶（DHPR）的催化。,诊断方法,新生儿期筛查 尿三氯化铁试验和2，4一二硝基苯肼试验 血浆游离氨基酸分析和尿液有机酸分析 尿蝶呤分析：,2. 型糖尿病发病（IDDM）与遗传有一定关系。,3. 系统性红斑狼疮的发病原因，尚不完全清楚，一般认为是多基因遗传，可能与遗传、性激素、环境

7、等多种因素相互作用造成机体免疫功能紊乱有关。,第一节 遗传病的临床诊断 第二节 细胞遗传学检查 第三节 生化检查 第四节 产前诊断 第五节 基因诊断,第四节 产前诊断,产前诊断（prenatal or antenatal diagnosis）又称出生前诊断，是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作出诊断。,定义:,产前诊断可以有效地预防遗传病患儿的出生，降低遗传病的发病率。,一、产前诊断的对象,1.孕龄在35岁以上的高龄孕妇。 2.夫妇一方有染色体异常，特别是表型正常的染色体平衡易位携带者或生育过染色体异常患儿的孕妇。 3.曾生育过神管缺陷或先天畸形患儿的孕妇。 4.夫妇之一患有先

8、天性代谢病或生育过该病患儿的孕妇。 5.X连锁隐性遗传致病基因携带者孕妇及常染色体显性遗传不完全显性基因携带者孕妇。 6.习惯性流产或有死胎、死产史的孕妇。 7.夫妇之一有明显致畸因素接触史或服用不当药物的孕妇。,二、产前诊断的方法,1. 羊膜穿刺术（妊娠16-20周）,适用于诊断染色体病、先天性代谢病、神经管缺陷等,2. 绒毛取样术（妊娠9-12周）,该方法对母体和胎儿比较安全，而且诊断时间较早，有利选择是否继续妊娠。,3. 脐带穿刺术（妊娠18周） 常用于血液系统疾病诊断、先天代谢疾病、染色体病等疾病的诊断。是绒毛和羊水检查可靠的补救措施。,4. 超声波检查： 临床常用、首选的诊断方法。

9、常用于神经管缺陷、外在发育畸形、先天性心脏病等器官组织发育畸形疾病的检测诊断。 亦可作为取样、穿刺及胎儿镜查的主要辅助手段。,5. 孕妇外周血分离胎儿细胞,6. 胎儿镜检查 由于操作困难，产生并发症可能性大，故临床应用极少。 7. X线检查 对胎儿发育有明确的危害。 8. 植入诊断,第一节 遗传病的临床诊断 第二节 细胞遗传学检查 第三节 生化检查 第四节 产前诊断 第五节 基因诊断,第五节 基因诊断,定义： 基因诊断（gene diagnosis）是指利用DNA分析技术直接从基因水平（DNA或RNA）检测遗传的基因缺陷，从而对疾病做出诊断。,传统的诊断：表现型基因型 基 因 诊 断：基因型表

10、现型 （ 逆向诊断）,基因诊断特点：,针对性强，特异性高,检测灵敏度和精确性高,实用性强，诊断范围广,不受材料来源影响,症状前诊断,产前诊断,一、基因诊断的基本方法,1. 核酸分子杂交技术 2. 聚合酶链反应 (PCR) 3. 基因测序 4. 基因芯片,1. 核酸分子杂交技术,（1）Southern 印迹杂交： 直接检测致病基因内部的突变，如缺失、插入、倒位以及限制性内切酶酶切位点的改变。 限制性片段长度多态性（RFLP）连锁分析： 进行致病基因遗传标记连锁分析，需结合家系图谱进行连锁分析，判断基因型。 （2）斑点印迹杂交：检测样品中核酸量的高低。,（4）等位基因特异性寡核苷酸（ASO）杂交法

11、: 主要是根据已知基因突变位点、设计、制备与野生型或突变型基因序列互补的基因探针，经过杂交结果分析是否存在基因突变，判断基因类型。,（3）荧光原位杂交（FISH）技术： 用于检测染色体异常和染色体基因定位，可直接在细胞核中或染色体上确定DNA顺序，广泛应用于肿瘤、遗传病的基因诊断。,2. 聚合酶链反应（PCR）技术,（1）PCR-RFLP：将聚合酶链反应（PCR）与限制性片段长度多态性（RFLP）分析方法相结合的一种检测技术。, 在相应酶切位点两侧设计PCR引物，扩增目标DNA； 酶切PCR产物，检测产物中是否含有酶切位点； 电泳分离酶切后PCR产物，根据电泳图谱结合家系图谱进行分析判断。,（

12、2）PCR-SSCP：单链构象多态性（single -strand conformation polymorphism，SSCP）是一种检测核酸序列中点突变的技术。 基本原理是提取含有突变位点的DNA片段，当双链DNA变性为两条单链后，会在中性条件下形成不同空间构象，导致电泳的泳动速度不同，从而鉴定有无基因突变。,（3）PCR-ASO：将扩增DNA片段分别与野生型和突变型探针杂交，根据检测标本与两种探针杂交信号的区别，确定是否存在基因突变，分析受检者的基因型。,（4）RT-PCR：主要用于基因表达水平的检测和分析。,3. DNA 测序方法 优点：快速、准确、微量、分辨率高、重复性好。,4. 基

13、因芯片技术 优点：微量化、高通量、并行化和高度自动化，可适用于多个基因、多个位点的同时检测。 基因突变、基因的多态性，组织细胞的基因表达情况。,二、基因诊断的主要途径,1. 直接诊断,通常使用基因本身或侧翼序列的DNA作为探针直接探查基因有无突变、缺失、重复等异常，是否存在表达的改变。 主要适用于已知基因异常疾病的诊断。,2. 间接诊断,DNA 多态标记系统是否和致病基因具有高度相关性，是是否采用此方法进行相关基因诊断的依据。,遗传病的基因诊断方法,三、基因诊断技术的应用,1. PCR技术诊断遗传病,途径： 基因突变位点的直接检出 筛查与遗传病有关的点突变 遗传多态性标记连锁分析间接诊断 利用

14、mRNA逆转录为cDNA进行分析或直接分析mRNA,进行PCR检测，除了具备酶，底物及其它基本因素外， 遗传病的基因结构必须部分或全部清楚。,(1) PCR技术直接诊断遗传病,基因缺失突变,基因的重排,突变位点不清楚或突变位点多变的基因,基因点突变影响到限制内性切酶切点,(2) 利用连锁分析间接诊断遗传病, PCR-RFLP,PCR扩增后用相应的内切酶进行切割相应的扩增产物，通过用琼脂糖凝胶或聚丙烯胺凝胶电泳技术进行电泳，分析酶切位点多态性，在家庭间进行连锁分析。,正常个体,杂合子,纯合子,分子杂交法检测RFLP示意图, Amp-FLP,VNTR(数目可变的串联重复序列 STR(短的串联重复序

15、列),目前已广泛应用多种遗传病的连锁分析如DMD/BMD，PKU等。,选择合适的特异性诊断探针和诊断方法是遗传病基因诊断成败的关键。,2. 基因芯片技术在遗传病诊断中的应用,(1) 基因芯片的工作原理,(2)基因芯片的应用,P53基因芯片 卵巢癌中基因表达谱 乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的碱基置换、插入和缺失(15 bp)突变 基因表达图谱 基因多态位点及基因突变的检测 芯片杂交测序技术,四、遗传病基因诊断举例,1甲型血友病的分子遗传学研究,由凝血因子缺乏所引起的出血性疾病，呈X连锁隐性遗传。,基因长约180kb，位于Xq28，含有26个外显子。成熟蛋白质包

16、含2332个氨基酸，分子量约265kDa。 因子的生理作用是作为X因子的辅助因子，被活化的因子(Fa)激活，从而将血液凝固的信号放大许多倍。,（1）甲型血友病的基因突变类型,基因重排 单碱基置换 缺失 插入,（2）突变检测,直接检测突变 内含子22基因重排的检测 应用DNA多态性进行遗传学分析,限制性内切酶片段长度多态性 短串联重复顺序(STR) 可变数目的串联重复顺序(VNTR),2. DMDBMD基因诊断的研究,类型：杜兴氏肌营养不良(DMD ) 贝克氏肌营养不良(BMD) X连锁隐性遗传,(1) DMDBMD基因的分子生物学特点,DMD 基因定位于Xp21.2,基因组DNA全长2.4Mb，包含79个外显子和78个内含