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1、高效液相色谱法,High Performance Liquid Chromatography,高效液相色谱仪器,目录,仪器的结构 分离原理 分离特点和局限性 分类 应用范围 建立方法的步骤,高效液相色谱仪器的结构,高效液相色谱仪器的结构,一般分为4个主要部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度洗脱、自动进样及数据处理等。 工作过程如下： 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入 色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样 品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱 柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检 测器送出的信号记录下来，由此
2、得到液相色谱图。,1. 高压输液系统：,一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。 高压泵应满足如下要求： 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。 能抗溶剂的腐蚀，耐酸、耐碱。 有较高的输送压力。一般分离，6.0104 Pa压力；高效分离，要求达到1.53.0107 Pa的压力或更高。 泵的死体积要小，便于迅速更换溶剂和进行梯度淋洗。,在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注
3、入取样环少量样品，即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。,2. 进样系统,3. 分离系统-色谱柱,色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其它金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长1530 cm，内径为45 mm，凝胶色谱柱内径312 mm，制备柱内径较大，可达25 mm 以上。,在液相色谱中，有两种基本类型的检测器: 溶质性检测器：仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，有紫外UVD、荧光FD、二极管阵列检测器DAD等。 总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或化学性
4、质有响应，有示差折光检测器RID、电化学检测器ECD、蒸发光散射检测器ELSD和质谱检测器MSD等。,4. 检测系统,分离原理,由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。,分离特点和局限性,特点： 高速：HPLC分离效率高，速度快，一次几分钟和几
5、十分钟就可完成。色谱柱的寿命长，可达两年以上。 高效：HPLC高压(26 MPa)下操作，填料颗粒小(250 m)，规则均匀的固定相，传质阻力小，柱效高(N=400060000 块/m)，分离效率高。 高灵敏度：现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器，使分析灵敏度比经典色谱有大提高（紫外检测器最小检测限可达10-9 g；荧光检测器最小检测限可达10-1110-13 g。 高自动化：HPLC进样量小(XX0 L)。带有自动进样装置和工作站。,分离特点和局限性,局限性： HPLC具有应用范围广的特点，但是也有一些局限性。首先，其分析成本高于气相色谱法，且易引起环境污染，当进行梯度洗脱时，比气象色
6、谱法的程序升温操作复杂。且HPLC的灵敏度还有待提高。,方法分类,高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度510m。适用于分离分子2001000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。,方法分类,2液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分
7、在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。,方法分类,3离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子
8、交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。 被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。 pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。 流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。,方法分类,4离子对色谱法 它是根据被测组分离子与离子对试剂离子
9、形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。 离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。,方法分类,5排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小
10、分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。,应用范围,色谱法适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物、生物活性物质和多种天然产物、合成的天然高分子化合物等，也适用于一些化药。他们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80%。其余20%的有机化合物，包括气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气象色谱分析法进行分析。,建立方法,不同组分在色谱过
11、程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。 一种HPLC分析方法的建立，除了了解样品性质，对液相色谱分离理论的理解，对前人从事过分相近工作的借鉴以及分析工作者自身的实践经验，都对分析方法分建立起着重要的影响。在建立一种新的分析方法时，必须解决以下问题： 1、根据被分析样品的特性选择一种是英语样品分析的高效液相色谱方法。 2、选择一根合适的色谱柱。各种物质不可能被一类固定相分离，固定相在不同类化合物的分离中起着相当重要的作用，它决定了物质的分离过程，也决定了流动相的基本性质。 3、选择适当或者优化的分离条件，确定流动相的组成、配比、流速以及洗脱方法。流动相的极性，流动相的选择性和流动相的优化，在很大程度上影响了组分的分离，这是因为在液相色谱中流动相参与色谱过程的分配作用，而且组分的最佳分离在很大程度上取决于流动相的选择和优化。 4、由获得的色谱图进行定量或者定性的分析。,
