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1、microRNA 的实时定量茎环 RT-PCR 技术摘要：已开发出一种新型的 microRNA（miRNA）的定量方法，即利用茎环反转录，Taqman PCR 分析。茎环 RT 引物在 RT 效率和特异性方面比传统的更好。TaqMan miRNA 的检测是很具体的，可以检测成熟 miRNA 和区分相关的甚至低至一个核苷酸的 miRNAs。此外，他们不会受到基因组 DNA 污染的影响。精确量化可以从低至 25 皮克的总 RNA 中提取大多数 miRNA。事实上，这种方法灵敏度高，特异性强和精密度高，允许无需核酸纯化，直接分析单个细胞。如标准 TaqMan 基因表达分析，TaqMan miRNA
2、的检测显示出了 7 个数量级的动态范围。七个小鼠组织中五个 miRNA 定量显示，在每个细胞中，有低至 10 到超过 30000 个拷贝数。这种方法可以确保快速，准确，灵敏 miRNA 表达谱，并能识别和监控特定组织或疾病的潜在生物标志物。茎环 RT-PCR 可用于其他小 RNA 分子，如短干扰RNA（siRNAs ）的量化。此外，为更好的特异性和效率，茎环 RT 引物设计的概念可以应用在小分子 RNA 克隆和多重检测。引言：miRNA 是自然发生的，高度保守的转录家庭，来源于较大的发夹前体。miRNA 是在动物和植物的基因组上发现的。到目前为止，有 1000 个独特的转录产物，其中，在桑格中
3、心 miRNA 的注册表中包括 326 人类 miRNA。miRNA 是通过催化 mRNA 的分裂或抑制 mRNA 的翻译来调节基因表达。他们被认为在细胞发育，分化和传导中发挥着重要作用。具体职责包括调节细胞增殖和新陈代谢，发育时间，细胞死亡，造血，神经发育，人类肿瘤形成与 DNA 甲基化和染色质修饰。虽然 miRNA 的相对丰富的转录产物类别，其表达水平在物种和组织之间相差很大。低丰度的 miRNA 经常逃避检测技术，如克隆， Northern 杂交和基因芯片分析。这里，我们提出一种新型实时定量方法，能够准确灵敏地检测 miRNA 与其他小分子 RNA。这种方法扩展了实时 PCR 技术，从大
4、分子的基因表达到微分子的变化检测。材料和方法从桑格中心的 miRNA 注册网站 http:/www.sanger.ac.uk/Software/ Rfam/mirna/index.shtml 中筛选目标，引物和探针。所有 TaqMan miRNA 检测，可通过应用生物系统公司（P / N4365409）得到。miRNA 标准 TaqMan 分析，采用 PrimerExpress 软件设计 PRI-LET-7A-3 和 PRI-MIR-26B 和 miRNA 前体 miR-30A。所有序列在补充资料部分可用。合成 miRNA 的寡核苷酸从 Integrated DNA Technolo-gies
5、 (IDT, Coralville, IA)购买。RNA 样本组织，细胞，细胞裂解物和总 RNA 制备从 Ambion 公司（P / N7810，7812，7814，7816，7818，7824，7826 和 7968）购买10-12 天老鼠的脑，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎的总 RNA 样品。 Ambion 公司鼠的总RNA 来自瑞士韦伯斯特小鼠。基于 TaqMan 基因表达分析人类或小鼠的 3 - 磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH ）内对照（P / N4310884E4352339E，应用生物系统公司）所有的 RNA 样品进行标准化。两个细胞株 HepG2 和 OP9，培养，使用 Gibco
6、公司 MEM（P / N 12492-021，Invitrogen，Carlsbad, CA）补充 10胎牛血清（FBS）(P/N: SH30070.01, HyClone, Logan, UT)培养。用血球计对胰酶消化细胞计数。约 2.8106 个悬浮细胞通过离心沉淀，1500r.p.m.离心 5 分钟，用 1 毫升不添加 MgCl2 and CaCl2 的杜尔贝科的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。细胞再悬浮于 140 毫升 PBS，并用三种不同的样品制备方法处理。第一种方法，一个50 毫升的样本（10 6 个细胞）等量的核酸纯化裂解液混合，用吸管反复吹打十次，然后旋转。在添加到 RT 反应体系
7、前，将裂解液用 1 U / ml 的 RNase 抑制剂溶液稀释 1/10。在第二种方法中，用 mirVanamiRNA 提取试剂盒提取 50 毫升的样本（10 6 个细胞） 。纯化的总 RNA 在 100 毫升洗脱缓冲液中洗脱。第三种方法用 1PBS 稀释 1/2，95加热 5 分钟，在加入 RT 反应体系前立即在冰上保存。用 mirVana miRNA 检测试剂盒检测 miRNA 根据制造商的协议，使用 mirVana-miRNA 的检测试剂盒对 miRNA 杂交分析。由 IDT合成 RNA 探针。放射性同位素标记的 RNA 片段用气旋存储荧光粉系统进行检测和定量。反转录酶反应逆转录反应中
8、包含的 RNA 样品，包括纯化总 RNA，细胞裂解物，和热处理细胞，50纳米的茎环 RT 引物，1RT 缓冲液，每 dNTPs 浓度 0.25 毫米，3.33 U / L 的逆转录酶和 0.25 U / L 的 RNase 抑制剂。7.5 微升反应体系在 9700 温度循环器 96- 或 384-平板上16培养 30 分钟，4230 分钟，85 5 分钟，然后保持 4。所有逆转录反应，包括无模板对照和 RT 负对照，都进行一次重复。PCR采用标准的 TaqManPCR 试剂盒进行实时 PCR。 10LPCR 反应体系包括 0.67LRT 产物，1TaqMan Mix ，0.2M 的 TaqMa
9、n 探针，1.5m M 正向引物和 0.7M 反向引物。反应在 384-平台上 95培养 10 分钟，9515 秒 601 分钟 40 个循环。所有的反应一式三份。 C T 为在荧光通过固定阈值的循环数。荧光定量 CT 值转换成绝对数量的拷贝数，使用合成林-4 miRNA 的标准曲线。结果我们提出了一个新的 miRNA 的定量的实时 RT-PCR 技术方案。它包括两个步骤：RT和实时 PCR。首先，茎环 RT 引物是与 miRNA 分子杂交，然后用 Multi-Scribe 反转录。接下来，用传统的 TaqMan PCR，对 RT 产品进行定量。图 1。上图描述的是 TaqMan miRNA
10、的检测原理，基于 TaqMan 实时定量 miRNA 的包括两个步骤，茎环 RT 和实时 PCR。茎环 RT 引物结合在 miRNA 分子的 3端和用反转录酶逆转录。然后，RT 产品使用传统的 TaqMan PCR 定量，其中包括特定 miRNA 的正向引物，反向引物和染料标记的 TaqMan 探针。尾正向引物 5的作用是根据 miRNA 分子的序列组成增加其熔融温度（Tm） 。图 2。TaqMan-4 miRNA 的检测的动态范围和灵敏度。 （A ）4 超过 7 个数量级的 lin-4 miRNA 扩增曲线。合成的 RNA 输入范围从 1.3103 fM（相当于每次反应 7 个拷贝数） 1.
11、310 4 FM（相当于每次反应 7107 拷贝数） ；（B） lin-4 miRNA 的标准曲线。miRNA 定量的动态范围和灵敏度的计划使用一种人工合成的 CEL-LIN-4 靶进行首次评估。合成的 RNA 在 A26 值的基础上量化，稀释超过 7 个数量级。 CEL-LIN-4 TaqMan miRNA 的检测结果显示在目标输入和 CT 值之间有极好的线性关系，表明，该检测有至少7 个动态范围，并能够检测 PCR 反应中少于 7 个的拷贝数（图 2） 。采用小鼠肺总 RNA 的八个额外 miRNA 的检测也被证实。RNA 的输入范围从 0.025到 250 纳克（图 3） 。 相关的 R
12、NA 输入的 TheCT 值超过 4 个数量级（R20.994 ） 。阴性对照检测中，即使在 250 纳克总 RNA 鼠标的反应中，CEL-MIR-2 没有给出一个检测信号。根据七个不同的鼠组织中五个 miRNA 的表达谱测定，创建一个 miRNA 的表达图谱。每个细胞中的拷贝数根据输入的总 RNA（假设 15 皮克/ 细胞）和合成 lin-4 目标的标准曲线计算。从这个表达图谱上作了一些有趣的观察。首先，miRNA 非常丰富，组织中每个细胞平均有 2390 个拷贝数。每个细胞表达的拷贝数在 10-32090 之间变化。在所有组织中，12个 miRNA 里，miR-16 和 miR-323 是
13、最丰富和最低量表达的 miRNA。此外，每个组织都有独特的 miRNA 的表达水平。 miRNA 表达的整体水平在小鼠肺中最高和胚胎中最低。最后，在 7 个组织中，miRNA 表达的动态范围变化很大，从不到 5 倍(let-7a) 到超过 2000 倍(miR-323) （表 1） 。 评估 RNA 分离的需要，我们直接在 miRNA 的检测中增加了细胞裂解物。相当于直接在 7.5 毫升逆转录反应中添加 2.5-2500 细胞。当检测到，在一些细胞中 CT 值相关R20.998）的 RT 反应至少有三个数量级（图 4） 。图 3。总 RNA 输入的阈值循环（CT）值检测 8 个 miRNA 的
14、相关性。每 RT 反应中，小鼠肺总 RNA 输入范围从 0.025 到 250 纳克。将新杆状线虫的 miRNA（MIR-2）列入作为阴性对照。鼠或人的脑，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎（10-12 天）的总 RNA 样品均购自Ambion 公司。根据标准曲线 lin-4 合成的 miRNA 对每个细胞拷贝数进行估计。每个 RT 反应中添加 150ng 的 RNA（或相当于约 10 000 个细胞，假设每个细胞中有 15pg 总 RNA） 。依据 TaqMan 磷酸甘油醛脱氢酶的内对照（P / N4352339E）将 RNA 规范化输入。检测了 12 组非特定的基因组 DNA 对 TaqMan
15、miRNA 的影响。结果表明，RT 反应中是否添加 5 纳克人类基因组 DNA 对 CT 值没有影响，表明 RNA 的目标（数据未显示）检测是非常特异的。基于这一观察，我们直接 miRNA 定量检测中增加了热处理细胞。图 5显示了使用纯化总 RNA，细胞裂解物，从同样数目的 HepG2 细胞得到的热处理细胞的miRNA 进行定量比较。直接添加热处理细胞的 miRNA 的检测 CT 值最低，和其他三种不同的样品制备方法相似。 图 4。使用 OP9 细胞裂解物检测 TaqMan miRNA 的动态范围。 每个 RT 体系中输入细胞数范围为 3 至 2500 个细胞。采用新杆状线虫 elegans
16、miRNA（MIR-2）作为阴性对照。图 5。对热处理细胞，细胞裂解液和 10 miRNA 实时定量总 RNA 进行比较。用阈值循环（CT）来衡量 miRNA 的表达水平。每 PCR 扩增约 400 HepG2 细胞进行了分析。 图 6。的 TaqMan miRNAmiR-16 的分析比较来解决以印迹杂交为基础的分析。总 RNA 来自小鼠肾，肝，肺，脾和睾丸组织。由两个独立运行系统（数据未显示）对 12 miRNA16 重复检测 TaqMan miRNA 的可再现性。CT 的标准偏差平均为 0.1，显示检测的高精度。我们采用一个独立的技术，这个技术是基于杂交印迹的 miRNA 分析，比较 TaqMan miRNA 的检测（图 6） 。我们观察到杂交为基础的 miRNA 分析重复性差，在从目标到目标的变化中和 TaqMan 分析一致。五个鼠组织样本中的 miR-16 的两种方法（R2= 0.916）一致。然而，在低丰度的 miRNA 中相关性相对较低，如
