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1、1麦冬水溶性多糖 OPB 的分离纯化及抗氧化活性研究【摘要】 目的：从麦冬中提取出水溶性粗多糖 OP，经分离纯化，得到均一多糖 OPB，并研究其组成、性质以及抗氧化能力。方法：粗多糖经 DEAE Sepharose CL6B 柱层析分离纯化得到 OPB，经 HPLC 和醋酸纤维素薄膜电泳法检验其均一性，超氧阴离子清除实验和羟自由基清除实验鉴定其抗氧化能力。结果：OPB 是均一组分多糖，GC 分析表明它的单糖组成是葡萄糖。结论：OPB 有较强的超氧阴离子清除作用。 【关键词】 麦冬；水溶性多糖；分离纯化；抗氧化活性基金项目:国务院侨办科研基金资助项目(07QZR07);福建省自然科学基金计划资助
2、项目(Z0516009)麦冬为百合科沿阶草属植物的干燥块根，是常用的滋阴中药，始载于神农本草经 ，有滋阴生津，润肺清心的功能1 。为了合理利用麦冬资源并寻找新的麦冬有效成份，本文对麦冬粗多糖进行分离纯化，并对其抗氧化活性进行了研究。1 材料与方法1.1 材料、试剂与仪器 材料：麦冬，购于福建泉州百合药店。试剂与仪器：氯化硝基氮蓝四唑(NBT)，吩嗪硫酸甲酯(PMS)，脱氧核糖，硫代巴比妥酸(TBA)及还原型辅酶 I(NADH2Na)，标准品为 Sigma 公司试剂；DEAE-sepharose CL6B 为 Pharmacia 公司产品；其他试剂均为上海化学试剂有限公司分析纯。MC992 自动
3、核酸蛋白分离层析仪，上海沪西分析仪器厂；高效液相色谱，安捷伦 HP1100；气相色谱仪，安捷伦 6890N。1.2 实验方法1.2.1 麦冬粗多糖的提取 准确称取麦冬 200 g，加入 2000 mL 80%乙醇，在50水浴中回流提取 6 h，过滤，将残渣烘干后取 100 g 加入 4000 mL 蒸馏水，90恒温水浴下提取 2 h，过滤，滤液在 60减压旋转蒸发浓缩至小体积，离心10 min(3500 r/min)，弃去沉淀物，上清液加入 4 倍体积无水乙醇，4过夜。次日离心，取沉淀，沉淀常规干燥得粗多糖。1.2.2 粗多糖的 DEAESepharose CL6B 柱层析制备 500 mg
4、麦冬粗多糖溶于 10 mL 蒸馏水，上样，先后用蒸馏水和 01M NaCl 进行洗脱，流速 40 mL/h,1 管/12 min，自动部分收集器收集。用苯酚 硫酸法测定糖的分布情况，制定洗脱分布图，按各波峰范围部分收集洗脱液。由分离层析仪中的 UV160A紫外光谱于 280 nm 下同步检测蛋白质，记录仪记录。21.2.3 多糖样品纯度鉴定方法 采用 HPLC 和醋酸纤维素薄膜电泳法，色谱柱为 SUGAR KS804 ，水作流动相，流速 1 mL/min，柱温 50，示差检测器检测。1.2.4 性质分析2-3 红外光谱分析确定是否含有多糖特征吸收峰；采用气相色谱法(GC)分析糖组成；糖含量测定
5、采用苯酚 硫酸法；蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法。1.2.5 体外抗氧化实验4-5 超氧阴离子清除能力实验用样品浓度为0(对照)，25，50，70，100 和 120 mg/mL；羟自由基清除作用样品浓度为 0(对照)，1.56，3.125，6.25，12.5，25 和 50 mg/mL。2 结果与分析2.1 粗多糖的提取与分离纯化 麦冬经水提取，粗多糖得率为 28.5%，命名为 OP。OP 的蒸馏水洗脱液经苯酚 硫酸检测只含有一个糖洗脱峰，但含量较少，暂且不做分析。OP 经 DEAE-Sepharose CL6B NaCl 梯度洗脱曲线如图 1 所示。由图 1 可以看出，OP 经 0-1M
6、NaCl 梯度洗脱，洗脱液经苯酚 硫酸检测只含有一个糖洗脱峰，紫外检测仪在 280nm 下也检测到一个蛋白质洗脱峰，并且与糖洗脱曲线相吻合，可能是结合蛋白，收集 25-55 管洗脱液，透析，浓缩，醇沉，沉淀常规干燥命名为 OPB。2.2 OPB 的纯度鉴定 配制 0.1%的样品液，0.4 m 纤维素膜过滤，进样量20 L。OPB 的高效液相色谱结果(图 2)检测出单一对称峰，证明 OPB 是纯度较好的样品。OPB 的醋酸纤维素薄膜电泳结果只显示一条区带，再次验证 OPB 为纯度较好的样品。2.3 OPB 的性质分析 经苯酚 硫酸法和考马斯亮蓝法检测得出 OPB 糖含量95.8%，蛋白质含量 4
7、%。2.3.1 OPB 的单糖组成分析 OPB 经酸水解，衍生化后的气相色谱结果如图 3所示。由于在衍生物的制备过程中会产生衍生物的异构体，使得色谱分析时每种单糖会产生几个峰，对照标准单糖的气相色谱图，2 min 前是溶剂峰，5.098 min 和 5.868 min 出现的峰代表葡萄糖，5.475 min 出现的峰是内标甘露醇，所以得出 OPB 由葡萄糖组成。图 1 OP 的 DEAE Sepharose CL6B NaCl 洗脱曲线（略）图 2 OPB 的 HPLC 图谱（略）图 3 OPB 的 GC 图谱（略）2.3.2 OPB 的红外光谱分析 红外光谱分析表明，OPB 在 3600-3
8、200 cm 有-OH 吸收峰，在 2923 cm 左右有一吸收峰，为-CH、-CH2 的共振吸收峰，在 1635 cm 左右有多糖的水合振动峰，证明 OPB 的主要成分是多糖。32.3.3 OPB 的分子量分析 多糖样品的分子量测定采用高效液相色谱法，高效液相色谱柱为 SUGAR KS804 ，水作流动相，流速 1 mL/min，柱温 50，示差检测器检测。先测出各标准品 T2000，T500，T10，T70，T40 及葡萄糖的保留时间，按公式 Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)求出对应的 Kav，以 LogMw(分子量的对数)对 Kav 作图得标准曲线，如图 4。同样测出样品的保留时间
9、，求出其 Kav，从标准曲线上即可求出其分子量，根据 OPB 的保留时间得出 OPB 的分子量是 4 万左右。2.4 OPB 体外抗氧化作用如图 5 所示，OPB 对超氧阴离子的清除作用随反应体系中添加量的增加而逐渐升高，呈现量效关系。OPB 在反应体系含量达 12 mg 时，对超氧阴离子的清除率达到 93.95%;从图 6 可以看出，OPB 有一定的清除羟自由基作用，当样品含量大于 0.156 mg 时，OPB 即显示抑制羟自由基的能力，随着反应体系中 OPB 含量的升高，抑制作用也逐渐加强，但增加的较缓慢。图 4 log MwKav 校正曲线（略）图 5 超氧阴离子清除作用（略）图 6 羟
10、自由基清除作用（略）3 结论为除去麦冬中皂甙、单糖、双糖、低聚糖、苷类、生物碱、茶多酚、氨基酸、醇溶性蛋白质物质，我们用 80%乙醇回流对麦冬进行预处理。得到的残渣烘干后用于水煮提取，得麦冬粗多糖。粗多糖经 DEAE Sepharose CL6B 柱层析分离纯化，在 NaCl 梯度洗脱后得到一个组分 OPB，杂蛋白全部在 70 管后才被洗脱出来，所以粗多糖经 DEAE Sepharose CL6B 柱层析后得到很好的分离纯化。通过高效液相色谱和醋酸纤维素薄膜电泳鉴定，OPB 是纯度较好的样品，经红外光谱鉴定 OPB 有多糖的特征吸收峰，气相色谱研究表明，OPB 由葡萄糖构成。OPB显示较强的超
11、氧阴离子的清除作用，在反应体系含样品量达 12 mg 时，对超氧阴离子的清除率达到 93.95%。【参考文献】1吕丽娟,马明辉,贡济宇,等.正交实验法优选麦冬多糖提取工艺J.长春中医药大学学报,2007,23(2):30-31.2陈凤清,陈智博,温得中,等.长白山松杉树芝子实体水溶性粗多糖的纯化及结构初探J.吉林中医药,2005,25(12):53-54.3邢文善,纪耀华,张彦形,等.半枝莲粗多糖的提取及总糖的含量测定J.吉林中医药,2005,25(7):56.44Zhaojing Wang,dianhui Luo.Antioxidant activities of different fractions of polysaccharide purified from Gynostemma pentaphyllum MakinoJ.Carbohydrate Polymers,2007,68:54-58.5王昭晶,罗巅辉.穿山龙多糖的提取,纯化与抗氧化活性研究J.天然产物研究与开发,2007,19(1):29-34
