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1、PCR引物设计及相关软件使用,重庆大学生物工程学院杨应斌,主要内容,背景PCR引物设计原则常用PCR引物设计软件Primer Premier 5.0 介绍Oligo 6.22 介绍在线Primer3 介绍,PCR,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。,PCR,引物设计
2、是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。,引物设计的原则,引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。,影响因素,如引物长度（primer length），产物长度（product length）序列Tm 值(melting temperature)引物与模板形成双链
3、的稳定性(internal stability, 用G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值,在错配位点（false priming site）的引发效率引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。,一般原则,引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致
4、错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。,一般原则,3.引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。,一般原则,4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72左右可使复性条件最佳。Tm 值
5、的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。,一般原则,6. G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。,一般原则,7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。,一般原则,8. 对引物的修饰一般是在5端增
6、加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。,常用的引物设计软件,Oligo 6 （引物评价）*Premier Primer （自动搜索）*Vector NTI SuitDnasisOmigaDnastarPrimer3 （在线服务）*,Primer Premier 5.0 的使用技巧简介,主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析,简并引物设计,根据氨基酸序列来设计引物DNA引物Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）2、无脊
7、椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）3、支原体（Mycoplasma）4、植物线粒体（Plant Mitochondrion）5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）6、一般标准（Standard）7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）,Primer Premier 5.0使用介绍(1),Preimer Premier 启动界面,Load sequence,基本信息,Sequence name,Original sequence,Use these
8、 two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好,Choose a function,引物设计界面,First you can design the primer manually,Sense strand or anti-sense strand,Useful information of the primer,引物搜索选项设定,引物类型,搜索模式,5引物位置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,搜索结果,28对引物,引物分值100分为满分,每对引物的
9、信息,双击选中一对引物,引物信息,回到主窗口,引物及产物信息,是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But ,引物编辑,引物编辑,Edit primer here,Analysis the edit result,Accept the edit result Return to the main window,Some other useful function of PP5,Enzyme,Melting temperature graph,Per 25-mer
10、,GC% graph,Per 25-mer,Stability,Per 5-mer,心肌特异性表达双顺反子载体的构建,pIRESneo2质粒克隆扩增,MYL2序列查询及启动子功能分析,不加酶切位点引物设计,基因组DNA制备,高保真PCR Cloning,大量纯化的MYL2 promoter片段,酶切获得无promoter线性质粒载体片段,DNALigation Reaction,转入DH5a,Colony Screening,PCR Identification,MYL2promoterpIRESneo,pEGFP-c3质粒克隆扩增,酶切获取MYL2promoterPlasmid vector
11、开环分子,酶切获得EGFP片段,酶切及凝胶电泳鉴定及回收,环状DNA分子,DNALigation Reaction,环状DNA分子,转入DH5a,Colony Screening,PCR Identification,rat原代胚胎心肌细胞培养及冻存,MYL2promoterpIRES/neo/EGFP,心肌细胞,脂质体,荧光鉴定,rat心肌细胞特异表达EGFP,无绿色荧光蛋白表达,达到目的,两端不含酶切位点的MYL2/prmoter片段,5端含酶切位点的引物,PCR,两端含酶切位点MYL2/prmoter片段,TA克隆,Strategy of Construct,MYL2序列查询及分析,Primer5.0软件安装及引物设计,网上下载软件利用密码生成机破解软件并激活软件,心肌特异性表达载体构建,线性载体准备,
