《生物化学实验教案》ppt课件

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1、生物化学实验,实验 Folin-Wu法定量测定血糖的含量,一、目的要求 1、掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。 2、学会制备无蛋白血滤液。,二、实验原理,Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+(Cu2O) Cu2O +酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物 OD420比色 无蛋白血滤液中的葡萄糖和碱性硫酸铜溶液共热反应，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）,Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝 。 血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。,二、实验仪器,1、新鲜兔子血 2、滤纸 3、血糖管

2、（25ml） 4、奥氏吸管（1ml） 5、锥形瓶（50ml） 6、 漏斗 7、电炉 8、水浴锅 9、7200型可见分光光度计,血糖管,奥氏吸管,7200型分光光度计,1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） (1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。 (2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。 2、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。 3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。 4、碱性硫酸铜溶液 A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸

3、馏水，稀释定容至1000ml. B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 临用时，A液：B液=15：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4）。,四、实验试剂,5、酸性钼酸盐溶液： 称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。 置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。,1、无蛋白血滤液的制备： 用

4、奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂草酸钠）1ml,缓缓放入50ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀。再加0.33mol/LH2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置515分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO412滴）。 用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。,五、实验步骤,2、血糖的定量测定： 取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入1ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加1ml标准葡萄糖液；用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液1ml，放入第

5、三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420波长处比色，以空白管调节零点。,按下式计算100ml全血中所含血糖的含量 m=OD1/OD2 C 10 100 式中: m=100ml全血中含血糖毫克数 C=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml） OD1=样品液光密度值 OD2=标准液光密度值,六、结果计算：,实验 肝糖元的提取和鉴定,一、实验原理 糖原在浓碱中稳定，将肝组织先置于浓碱中加热，是蛋白质及其他成分分解而保留肝糖元。再用浓硫

6、酸使糖原脱水生成糖醛衍生物，衍生物和蒽酮作用形成蓝色化合物，与同法处理的标准葡萄糖一起比色定量。,二、实验仪器 1、 新鲜肝脏 2、 100ml容量瓶 3、 7220分光光度计 4、 水浴锅 5、 试管(ml、2ml、5ml),三、实验试剂,1、0.9%NaCl溶液：0.9gNaCl溶于100ml蒸馏水中 2、30%NaOH溶液：30gNaOH溶于100ml蒸馏水中 3 、标准葡萄糖溶液（0.05mg/ml）：准确称取5mg分析纯葡萄糖（预先在110干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定容至100ml. 4、显色剂：称取0.2g蒽酮加入100ml浓硫酸中。此试剂不稳定，以 临用时配用为宜，冰箱保

7、存可用45天,四、实验步骤 1、迅速处死小白鼠，立即取出肝脏，用0.9%NaCl溶液洗去附着的血液并用滤纸吸干，准确称取肝组织0.5g，放入盛有1.5ml30%NaOH的试管中，置于沸水浴中加热20分钟，取出后冷却，将管中内溶物全部转移到100ml容量瓶中（用蒸馏水多次洗涤试管，一并收入容量瓶）加蒸馏水定容。 2、取干燥试管三支，注明空白管、标准管、测定管，按下表进行操作。加毕，摇匀，置沸水浴中10分钟，冷却，以空白管调节零点，在620nm波长下比色测定。,五、结果计算 100g肝组织中所含糖原的克数 =（od测/od标）c标2100（1/1000） （100/111） （100/0.5） 注

8、：100/111是此法测的葡萄糖含量换算为糖原含量的常数，即100g糖原用蒽酮试剂显色相当于111g葡萄糖用蒽酮试剂所显得色,实验 蛋白质的部分性质,一、试验原理 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。,第一部分、蛋白质的颜色反应,二、实验仪器 1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴锅 三、实验试剂 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸

9、馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。 2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。 3、Millons试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。 4、尿素晶体 5、1%CuSO4：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml 7、浓硝酸 8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml. 9、 冰醋酸 10、浓硫酸,四、实验步骤 （一） 米伦（Millons）反应 原理：米伦试剂是硝酸、

10、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚集团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。 操作： 1、苯酚实验： 取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millons试剂0.5ml，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。 2、蛋白质实验： 取2ml蛋白液，加Millons试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。,（二） 双缩脲反应 原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也

11、能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。 操作： 1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化成液体， 此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至液体重新结晶出现白色固体时， 停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。 2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。,（三） 黄色反应 原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物。 操作：取一支试管，加入1

12、ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有什么变化？,（四） 茚三酮反应 原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。 操作：取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。,第二部分、蛋白质的沉淀反应,一、试验原理 蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。

13、,二、实验仪器 1、移液管 2、吸管 3、试管 4、电炉 三、实验试剂 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。 2、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。 3、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。 4、95%乙醇。 5、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml 6、硫酸铜溶液：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 7、氯化钠晶体 8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml 9、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。 10、1%醋酸溶液。,四、实验步骤 （一）蛋白质的盐析作用 原理

14、：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。 操作：1、取试管1支，加蛋白液2ml，在加入饱和硫酸铵溶液2-4ml，摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。 2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵（每次加入量约为米粒大小），边加边摇，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。,（二）有机溶剂沉淀蛋白质 原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电

15、质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。 操作：取一试管加蛋白液1ml，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。,（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质 原理：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。 操作：1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。 2、取一支试管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混匀，观察结果。,（四）生物碱试剂沉淀蛋白质 原理：植物体内具有显著生理作用的

16、含氮碱性化合物成为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。 操作：取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。,实验五 双缩脲法测定蛋白质的浓度,一、实验原理 蛋白质在碱性溶液中可与CU2+形成紫色化合物，在一定浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的深浅成正比，可用比色法测定。,二、实验仪器 1、 试管 2、 吸管 3、 容量瓶 4、 7220分光光度计,三、实验试剂 1、1mg/ml卵清蛋白液：将1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml. 2、双缩脲试剂：将1.75gCuSO4.5H2O溶于约150ml蒸馏水，然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。,四、实验步骤 1、标准曲线的绘制：取7支