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1、临床医学论文-姜黄素酯化物抗平滑肌细胞增殖和调血脂作用研究作者：黄燕芬 洪行球 袁小凤【摘要】 目的 研究姜黄素酯化物对不同条件促牛主动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖作用和对小鼠食饵性高脂血症的影响，初步探讨其构效关系。方法 用丁二酸酐酯化姜黄素获得姜黄素酯化物；用 oX-LDL 或血管紧张素（Ang ）培养牛 VSMC 建立 VSMC 增殖模型，再在模型中加姜黄素和姜黄素酯化物培养，用 MTT 法检测观察二者对平滑肌细胞（VSMC）增殖作用的影响；用高脂膳食喂饲小鼠建立食饵性高脂血症模型，用姜黄素和姜黄素酯化物进行实验性治疗，给药 2 周后处死小鼠，测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和
2、高密度脂蛋白（HDLC ）含量，计算低密度脂蛋白（LDLC ）含量，观察其调血脂作用。结果 姜黄素酯化物浓度在 66mol/L、33mol/L、16.5mol/L 时，对 10 mg/L oX-LDL 培养的 VSMC 增殖有明显的抑制作用，P0.05；剂量在 0.3mmol/（kgd）时，可降低食饵性高脂血症小鼠血清 TG 含量 P0.05，但降 TC、LDLC 和上调 HDL 作用不明显。结论姜黄素酯化物高剂量时能明显抑制 oX-LDL 和 Ang 促牛 VSMC 增殖作用；能明显降低血清 TG 降低食饵性高脂血症小鼠血清 TG 含量。 【关键词】 姜黄素 酯化物 平滑肌细胞 调血脂Abs
3、tract：ObjectiveTo study the effects of the antiproliferation of ramifications of the curcumin esterified by succinic anhydride on the Bovine VSMC and regulating the lipids in hyperlipidemic mice induced by high lipid diet to study the relation between structure and effect.MethodsCurcumin was esterif
4、ied by succinic anhydride，MTT was used to observe the antiproliferation of the ramifications of the curcumin esterified by succinic anhydride on VSMC stimulated by oxLDL.Mice were fed with high lipid diet 1 week to be hyperlipidemic model,and then given experimental treatment with curcumin and ramif
5、ication of curcumin.The level of total cholesterol（TC） and triglyceride（TG）and HDLC in serum were all measured in 15 days.The level of LDLC was caculated.Results The ramification of the curcumin esterified（66mol/L）has obvious effect on the inhibition of VSMC stimulated by 10 mg/L oxLDL （P0.05）；And i
6、t has effects on decreasing the level of TG in serum of the mice induced by high lipid diet.Conclusion The results indicate that ramification of curcumin esterified by succinic anhydride has obvious effect on inhibition of VSMC stimulated by 10 mg/L oxLDL and 2 mg/L Ang .It has significant effects o
7、n decreasing TG in serum.Key words： ramification of curcumin esterified by succinic anhydride；smooth muscle cell；regulating the concentrations of lipids姜黄素是中药姜黄中的一种酚性色素，具有调血脂、抗氧化、抗肿瘤等广泛的药理作用14 。但其水溶性较小、生物利用度不高，引起了学者的关注，探讨解决的途径主要集中在药剂学方面。从化学结构分析，姜黄素有二个如同肉桂醛的苯丙烯酰基骨架，两个苯环上各有一个酚羟基和一个甲氧基，丙稀基与一个 双酮/烯醇式结构连
8、接。它的两个天然衍生物一脱甲氧基和二脱甲氧基姜黄素已报道有抑制平滑肌细胞、内皮细胞增殖，促进低密度脂蛋白受体表达，有降血脂、抗脂质过氧化和上调脂代谢相关酶类的活性作用58 ，在此基础上，笔者利用姜黄素母核中具有两个酚羟基，通过二分子丁二酸酐酯化，得到一个含二分子甲氧基、二分子羧基姜黄素酯化物（以下简称 REC）；观察它对牛 VSMC 增殖和小鼠食饵性高脂血症的影响，初步探讨其构效关系。1 材料与方法1.1 姜黄素酯化物（REC）的制备 取纯度大于 98%的姜黄素，加 NaOH 制成钠盐，溶解于无水吡啶，滴加于在室温下搅拌的无水丁二酸酐吡啶溶液中，反应结束后，取样薄层色谱用氯仿甲醇甲酸（9370
9、.7）展开，柱色谱分离得到姜黄素酯化物。以中国药品生物制品检定所,提供的姜黄素（批号 8239401 ）为对照品，利用姜黄素母核有 二酮基，可与硼酸在无水酸性条件下呈红色的原理，显色法测得纯度为92.2。1.2 牛 VSMC 培养 采用组织块法培养牛 VSMC。无菌条件下取新生小牛主动脉，分离中膜平滑肌层，剪碎贴块培养，培养液为含 20小牛血清的 RPMI1640 培养液，待细胞长满瓶底后，按常规方法用含 10小牛血清的 RPMI1640 培养液传代培养，取36 代细胞用于实验。1.3 oxLDL 的制备 取新鲜人血浆，经密度梯度超速离心、Sepharose 6B 凝胶过滤，得 LDL，用铜离
10、子氧化法氧化，Folinlowry 法测定蛋白含量，抽滤除菌，4 保存7。1.4 REC 对 oxLDL 促牛 VSMC 增殖的作用 取生长良好的 VSMC 以 104105/ml 接种于 96 孔培养板，每孔 100 l，37 、5 CO2 孵育 24h，待细胞贴壁后更换无血清培养液继续培养 24 h，使大多数细胞同步于 G1/G0 期后， 随机分 3 组：正常对照组为含 5小牛血清 RPMI1640 培养液 100l；oxLDL 组为上述等量培养液中加 oxLDL 至终含量为 10 mg/L；药物组为在 oxLDL 组基础上，加姜黄素及 REC 各至终浓度分别为 16.5，33，66 mo
11、l/L。37、5CO2 继续培养 48 h 后，将原培养液吸净，每孔加入 0.5 mg/ml 的 MTT 100 l，继续孵育 4 h，弃 MTT 液后每孔加DMSO 100 l 充分溶解深蓝色结晶，于酶标仪上 570 nm 测消光系数。计算其对 oxLDL 促牛 VSMC 增殖的抑制率，抑制率（试验组吸光度模型对照组吸光度）/模型对照组吸光度1001.5 食饵性高脂血症小鼠模型的建立与分组 取浙江中医药大学实验动物中心提供的清洁级昆明种小鼠 40 只各半，体重 1820g，每笼 5 只，饲养温度 231，湿度 40%70%。适应性饲养 3d后，随机分出 10 只为正常对照组，给予基础饲料喂养
12、（稃皮粉 25%，豆粉15%，鱼粉 10%，玉米粉 20%，4 号粉 25%，食盐 1%，鱼肝油 1%，其它 3%）；余下喂饲高脂饲料（胆固醇 2%，猪油 10%，胆酸盐 0.25%，蛋黄粉 10，基础饲料 77.75%），自由进食，1 周后，在继续喂饲高脂饲料同时，模型组给予20ml/（kgd）1%羧甲基纤维素灌胃，药物组给予 0.3mmol/（kgd）姜黄素和 REC 组用 20ml/（kgd ）1%羧甲基纤维素溶液调匀后灌胃，正常组每天灌服与模型组相同溶液。给药 15d 后处死动物，处死前一天晚上 8 时撤去饲料，第二天上午取血，血清用于测定 TC、TG 和 HDL。1.6 测定方法 血
13、清 TC、TG 用酶法测定，HDLC 用磷钨酸 镁沉淀法去 LDL 和 VLDL 后，上层再用酶法测定，试剂盒由宁波慈城生化试剂厂生产，LDLC 含量按公式LDLC=TCHDLC1/5TG 计算。2 结果2.1 REC 对 oxLDL 促牛 VSMC 增殖作用 实验可见，10mol/L 的 oxLDL 有明显的促牛 VSMC 增殖作用，P0.05； 姜黄素高、中、低剂量组，均有明显的抑制 oxLDL 促牛 VSMC 增殖作用,P0.05；REC 高、中、低剂量组有明显的抑制 oxLDL 促牛 VSMC 增殖作用，P0.05；结果见表 1。表 1 姜黄素酯化物对 oxLDL 促牛 VSMC 增殖
14、作用（略）2.2 REC 对小鼠血清 TC、TG、HDLC 、LDLC 含量作用 实验结果显示，姜黄素能降低血清 TC、TG、LDLC 和上调HDLC ，P0.05；姜黄素有调节血脂作用，姜黄素酯化物能明显降低TG，P0.05。结果见表 2。表 2 姜黄素酯化物对食饵性高脂血症小鼠血清脂质的影响（略）3 讨论根据现代药理学研究，姜黄素具有广泛的药理作用，而且不良反应小，很早就被世界各国关注。但姜黄素口服吸收率低、水溶性小、稳定性差、生物半衰期短、血药浓度低、生物利用度不高，为解决这些问题，有学者正在进行一些有针对性的研究，其中包括寻找合适的载体，以增加姜黄素的水溶性和口服吸收率，延缓生物半衰期
15、，如用聚乙二醇连接姜黄素改变剂型和给药途径，如将姜黄素制备成水包油乳剂，供注射给药等。为解决姜黄素水溶性小这一问题，本实验从药物化学角度入手通过对姜黄素母核上取代基的修饰来探讨这个问题。利用姜黄素分子中具有两个酚羟基结构，通过二分子丁二酸酐酯化，得到含二个甲氧基、二个羧基姜黄素酯化物；观察了姜黄素酯化物对 VSMC 增殖和小鼠食饵性高脂血症的影响，初步探讨其构效关系。姜黄素经丁二酸酐酯化后从理论上讲极性增大，实验结果我们得到一个小于二脱甲氧基姜黄素的黄色斑点，说明极性基团比姜黄素强；斑点在无水酸性环境中加硼酸呈红色，说明姜黄素基本母核没有被破坏，经推理应为姜黄素的一酚羟基酯化和二酚羟基酯化产物
16、。进一步的结构分析，有待通过波谱分析来验证。与姜黄素一样姜黄素酯化物高中低剂量均能能明显抑制 oxLDL 促牛 VSMC 增殖作用，说明就这点上我们改变了其极性，而没有改变其作用，这正是我们的目的之一，姜黄素酯化物高剂量时能明显降低血清 TG，但 降 TC、LDLC 和上调 HDL 作用不如姜黄素明显。这是否与姜黄素结构酚羟基被酯化有关有待进一步研究。【参考文献】1HONG Xinqiu ，WO Xinde.Influence of lipid metablish induceded by Lipid diet of Normal Human of extracts of curcuminJ.JOURNAL OF ZHEJIANG COLLEGE
