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1、药学论文-姜黄素抗顺铂肾毒性作用及其机制研究作者：张英 黄维义 王顺蓉 陈蓉【摘要】 目的探讨姜黄素（CMN）抗顺铂所致大鼠肾损害的作用及其机制。方法选择 48 只雄性 Wistar 大鼠，随机分为（n=12），（n=6），（n=6），（n=12）,（n=12）组，分别行第 1 次腹腔注射：生理盐水（，组）、CMN 30 mg/kg（组）、CMN 30 mg/kg+锌原卟啉（ZnPP）10 mg/kg（组），8 h 后，从，组中各任选 6 只鼠处死，检测 HO1 蛋白表达与活力。余鼠再行第 2 次腹腔注射：生理盐水（组），CMN 20 mg/kg+顺铂 6 mg/kg（组）。顺铂 6 mg/k
2、g（，组），5 d 后处死，检测血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、肾脏系数、肾组织超氧化物歧化酶（SOD）活力及谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量。结果顺铂可明显升高肾组织氧化应激水平并严重损伤肾脏的结构和功能，姜黄素仅有较弱的直接抗顺铂肾毒性作用，但用姜黄素预处理上调 HO1 蛋白表达及活力能显着增强其抗顺铂肾毒性作用；反之，用 ZnPP抑制 HO1 活力则可消除姜黄素抗顺铂肾毒性作用。结论 姜黄素主要通过上调 HO1 蛋白表达有效拮抗顺铂所致的氧化应激性肾损伤。 【关键词】 顺铂； 姜黄素； 血红素氧合酶1 ； 氧化应激； 肾毒性Study on the Protective Eff
3、ect and Mechanism of Curcumin on Cisplatininduced NephrotoxicityAbstract：Objective To investigate the protective effects of curcumin(CMN) on cisplatininduced nephrotoxicity in rats and the possible mechanisms. Methods48 male wistar rats were randomly divided into 5 groups：groupI(n=12),groupII(n=6),
4、groupIII(n=6),groupIV(n=12),groupV(n=12).Rats received intraperitoneally injection for the first time respectively with saline(groupI, groupII, groupIII),CMN 30 mg/kg (groupIV),CMN 30 mg/kg+Zinc protoporphyrin IX(ZnPPIX) 10 mg/kg(groupV).8 hours later，half rats in group I,groupIV,groupV were killed
5、to analyse renal HO1 protein express and activity.Other rats received the intraparitoneally injection for the second time respectively with saline(groupI),Cisplatin 6mg/kg+CMN 30 mg/kg(groupIII) and cisplatin 6 mg/kg(groupII, groupIV, groupV).5 days later,all the animals were killed to measure the b
6、lood creatinin(Cr), urea nitrogen(BUN) and analyse the renal superoxide dismutase(SOD) activity, glulathion(GSH) and malondialdehyde(MDA) content and histopathological lesion.ResultsCisplatin could increase the renal oxidative stress level and damage seriously the renal histology construction and fu
7、nction.CMN only has slight direct protective effect against the cisplatin-induced nephrotoxicity.But the renal protective effect would increased significantly by pretreatment with CMN to upregulate renal HO1 protein level and considerably attenuated by inhibiting HO1 protein activity with ZnPP.Concl
8、usionCMN can protect against cisplatininduced oxidative stress renal injury by inducing HO1.Key words：Cisplatin； Curcumin； Heme oxygenase1 ； Oxidative stress； Nephrotoxicity顺铂是当前临床上最常用的抗肿瘤药物之一，在诸如肺癌、膀胱癌、睾丸癌和卵巢癌等十余种肿瘤中被推荐为首选化疗药，但顺铂明显的肾毒性很大程度上限制了其在临床的应用。近年有研究报道，姜黄素（curcumin，CMN）能有效防止顺铂所致的急性肾损伤，但其作用机制尚
9、未完全阐明1。鉴于顺铂主要是通过促进自由基生成致使肾脏遭受氧化应激性损伤2，而血红素氧合酶1 （HO1 ）则是细胞应对各种氧化应激损伤最重要的内源性保护因子，因此，我们推测 CMN 有可能是通过诱导 HO1 表达发挥抗顺铂的肾毒性作用，但迄今尚未见国内外有相关的研究报道。本文拟对此作一探讨。1 材料与方法1.1 药品与试剂顺铂为云南个旧生物药业有限公司产品，批号：060701。锌原卟啉（ZnPP）及 CMN 购于 Sigma 公司。肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、超氧化物歧化酶（SOD）及蛋白定量检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。HO1 免疫组化检测抗体及试剂购于武汉博士德公司。1.2 动
10、物分组及处理选择健康雄性 Wistar 大鼠 48 只，体重 185230 g，随机分为 5 组：组（对照组，n=12）、组（单纯顺铂组，n=6），组（CMN 组，n=6）、组（CMN 预处理组，n=12），组（HO1 抑制组，n=12）。分别第 1 次经腹腔注射等容积生理盐水（，组），CMN 30 mg/kg（组），CMN 30 mg/kg+ZnPP 10 mg/kg（组），8 h 后，从，3 组中各任挑 6 只大鼠处死取肾检测 HO1 蛋白表达与活力。其余大鼠再分别第 2 次经腹腔注射生理盐水（组），CMN 30 mg/kg+顺铂 6 mg/kg（组），顺铂 6 mg/kg（，组）。动物如
11、平常自由进食摄水，5 d 后称重、处死，取血及肾检测各项指标。1.3 指标检测1.3.1 HO1 的检测采用 SABC 法检测肾组织内 HO1 蛋白表达。肾组织用 10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋、切片，切片常规脱蜡、至水，3%H2O2灭活内源性过氧化酶，经抗原修复、正常血清封闭后，滴加抗（抗 HO1 抗体，滴度 1:200）及抗（滴度 1100），DAB 室温避光显色，脱水、透明、封片，显微镜下观察，见胞浆有棕褐色颗粒者为 HO1 阳性表达细胞，用CD8 病理彩色图像分析系统在 200 倍光镜下，对每张切片随机测定 10 个不重复视野的肾小管上皮细胞 HO1 蛋白光密度值，取平均值代表 H
12、O1 蛋白表达量。HO1 活力测定参考姚海木3的方法进行，即取肾组织约 0.5 g，制成10%组织匀浆，高速离心分离微粒体，考马亮兰法定量蛋白浓度，再根据 HO1降解血红素生成胆红素的原理，通过测定反应体系中胆红素的生成量代表HO1 活力，单位为 nmol/(mg 蛋白h)。1.3.2 血 Cr，BUN 及肾组织生化指标测定按试剂盒说明书分别采用苦味酸法、二乙酰法测定血 Cr，BUN。称双肾重量，以每 100 g 体重对应的肾脏重量表示肾脏系数。取肾皮质约 1 g 制成组织匀浆，按试剂盒说明书操作步骤测定SOD 活力（黄嘌呤氧化酶法）、GSH（二硫代对硝基苯法）及 MDA 含量（硫代巴比妥法）
13、。1.4 组织病理学检查取小块肾组织置于 10%中性福尔马林液中固定，常规酒精、二甲基苯脱水，石蜡包埋、切片，HE 染色，光镜下观察组织形态学改变。1.5 统计学分析本实验所得数据均为计量资料，以(s)表示，组间比较采用 F+q 检验，用 SPSS11.0 统计软件完成。2 结果2.1 肾组织 HO1 蛋白表达量及活力变化免疫组化分析显示，HO1 蛋白主要表达于肾小管上皮细胞胞浆内，其中组代表基础状态，显示大鼠肾内HO1 蛋白表达量及活力均较低。，组虽未检测，但因预处理方法同组，故其 HO1 蛋白表达量及活力应与组相同。组显示 CMN 预处理显着上调了肾内 HO1 蛋白表达量及活力。组显示 Z
14、nPP部分抑制了 CMN 诱导 HO1 蛋白的表达量并显着抑制了 HO1 活力。见图 1 及表 1。表 1 HO1 蛋白表达量及活力的比较（略）与组比较，*P0.01；与组比较，P0.01；n=62.2 血和肾组织生化指标的变化与组相比，组单用顺铂使肾脏系数明显增加，血 Cr，BUN 明显升高，肾组织 SOD 活力及 GSH 含量显着下降，而 MDA含量显着增加；组显示与顺铂同时合用 CMN，上述指标的变化与组类似但程度稍轻，组显示用 CMN 预处理，上述指标的变化较组显着减轻；组显示用 ZnPP+CMN 预处理，上述指标的变化又与组相似，而较组显着。见表2。表 2 肾脏系数、血及肾组织生化指
15、标的比较（略）与组比较，*P0.05，*P0.01；与组比较；#P0.05，#P0.01；n=62.3 肾组织病理学变化组显示肾小球及肾小管结构清晰，无细胞肿胀及坏死脱落。组显示肾组织结构严重损伤，表现为肾小球充血，肾小管特别是近端小管上皮细胞明显浊肿，片状坏死、脱落，间质炎细胞浸润，管腔内有明显蛋白、细胞管型。组改变与组类似，但程度稍轻。组病理改变显着减轻，肾小球及肾小管结构基本正常，仅皮髓交界处小管细胞轻度肿胀，偶见坏死、脱落细胞，管型和炎细胞浸润均不明显；组则与组病变程度相似，也主要是肾小管严重受损，小管细胞明显肿胀、坏死、脱落，管腔内出现大量管型等。3 讨论顺铂是以 2 价铂为中心，同
16、 2 个氯原子和 2 个氨基结合而成的重金属化合物，其亲核氨基可与水分子作用产生大量的自由基，造成线粒体和细胞膜等氧化应激性损伤。另外，顺铂还可诱导一氧化氮合酶活性升高，促进 NO 生成，后者既可与超氧化物阴离反应成大量羟自由基，又可使蛋白中的酪氨酸硝基化，从而抑制 SOD 活力，加重细胞损伤4。我们采用一次性注射大剂量顺铂的方式，成功诱导了急性肾损伤大鼠模型，表现为肾功能衰竭，肾小管上皮细胞浊肿、坏死和脱落等病理改变，检测肾组织内 SOD 活力及 GSH 含量降低而 MDA 含量明显升高，证明顺铂主要通过氧化应激的方式损伤肾脏，从而为顺铂肾毒性的防治确定了靶标。已知 CMN 是从植物姜黄中提取的天然色素
