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1、临床医学论文-原癌基因产物 Ras 及 cerbB2 在着床前小鼠胚胎中的表达摘要：目的观察小鼠着床前的胚胎细胞中原癌基因 ras 编码的蛋白产物p21Ras 及 cerbB2 的表达,并了解其对着床前的胚胎发育的可能作用。方法采用免疫组织化学 ABC 法，检测着床前小鼠胚胎中 p21Ras 及 cerbB2 蛋白的表达。结果小鼠着床前的胚胎细胞中 p21Ras 的免疫反应呈阳性,阳性物质分布于胞质中,胚胎外透明带呈阴性反应；而在各期着床前的胚胎中均未检测到cerbB2 蛋白的表达。结论小鼠着床前的胚胎中，有原癌基因 ras 编码蛋白的表达,p21Ras 是增殖和分化受体介导的信号传导途径中的
2、重要组成部分，可能在小鼠着床前的胚胎发育过程中起重要的调节作用。CerbB2 基因对于围着床期子宫的生长发育具有重要的作用；而在小鼠着床前的胚胎发育过程中似乎不起重要作用。 Expressions of p21Ras and c erbB2 proteins in mouse preimplantations embryos Abstract: Aim To investigate the expressions and possible role of p21Ras and c erbB2 proteins in preimplantation mouse embryos. Methods
3、Detection of p21Ras and c erbB2 protein expressions by immunohistochemical ABC staining. Results Protein p21Ras was found in preimplantation mouse embryo from 4 cell stage to blastocyst stage. The positive staining substances were located in cytoplasm. Protein c erbB2 was not dectected in any stages
4、 of preimplantation mouse embryos. Conclusion Products of proto ;oncogene p21 ras present in mouse preimplantation embryos. It suggests that p21Ras may play a role in early embryo development. erbB2 proteins in preimplantation mouse embryos. Methods Detection of p21Ras and c erbB2 protein expression
5、s by immunohistochemical ABC staining. Results Protein p21Ras was found in preimplantation mouse embryo from 4 cell stage to blastocyst stage. The positive staining substances were located in cytoplasm. Protein c erbB2 was not dectected in any stages of preimplantation mouse embryos. Conclusion Prod
6、ucts of proto oncogene p21 ras present in mouse preimplantation embryos. It suggests that p21Ras may play a role in early embryo development. Keywords: ras gene; c erbB2 gene; embryo; immunohisto;chemical staining 从受精卵卵裂分化到形成成熟的个体，细胞中的某些原癌基因在某一特定的阶段处于一定的活化状。在生理情况下，它们的表达产物在细胞的生长、分化和信号转导等方面起着极为重要的作用。就
7、目前的资料看来，绝大多数原癌基因的表达开始于胚胎时期，其中多数主要在胚胎中期开始表达。近年来，国外有人研究发现，在着床前的小鼠胚胎中，可检测到一些原癌基因的表达，这些原癌基因对于着床前胚胎的发育起着重要的作用1。ras 基因的产物p21Ras 是一种 G 蛋白，为酪氨酸激酶的下游分子，在酪氨酸激酶信号转导途径中发挥作用。有人在小鼠囊胚期曾检测到 p21Ras 的表达，但在更早期的胚胎细胞中未见有 p21Ras 表达的报道。c-erbB2 基因表达于围着床期小鼠的子宫2，而在着床前的胚胎中是否有表达未见报道。我们从蛋白质水平，检测了这两种原癌基因在着床前小鼠胚胎中的表达，以探讨其在着床前的胚胎发
8、育中起的作用。 1材料和方法 1.1 材料孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)，由宁波第二激素厂提供。兔抗 p21Ras 多克隆抗体为北京中山生物技术有限公司产品。抗 c-erbB2 单克隆抗体(mAb)及 ABC 试剂盒，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。 1.2 方法 1.2.1 小鼠早期胚胎的获取选用本校动物中心 提供的一级健康昆明种小白鼠，雌雄兼用，鼠龄 810wk,体重(305)g,光照、黑暗各 12h，自由摄食、饮水。于雌鼠腹腔注射 10UPMSG，48h 后再腹腔注射 10UHCG 促超排卵，当晚与雄鼠 21 合笼。次日晨检查阴栓，按照 Liu 等3的方
9、法，将有阴栓者分别于注射 HCG 后 36，48，60 和 74h,颈椎脱臼法处死，在解剖显微镜下输卵管全段冲卵，收集 2 细胞、4 细胞、8 细胞及桑葚胚等不同时期着床前的胚胎。将卵裂球置于 APES 处理过的载玻片上，用 Bouins 液固定 24h。 1.2.2 免疫组织化学 ABC 法将置有卵裂球的玻片用 PBS 洗涤 3 次;甲醇双氧水处理 30min,以抑制内源性过氧化物酶的活性。以 PBS 洗 3 次后，依次分别加入兔抗 p21Ras 多克隆抗体及抗 cerbB2mAb(1 100 稀释),37孵育 1h 后转4过夜。二抗分别为生物素标记的羊抗兔和羊抗小鼠 IgG(1200 稀释
10、，室温孵育 1h)和 ABC 复合物(1100 稀释，孵育 30min 以上。每个步骤之间均以 PBS洗涤 3 次，每次 5min。最后加 DAB双氧水显色 1520min,用水洗终止反应。置 37温箱烘干后,二甲苯透明、封片。本实验中以生理盐水代替一抗作为空白对照，以正常兔血清代替一抗作阴性对照，用已知的 p21ras 和 cerbB2 阳性的肿瘤标本作为阳性对照。 2结果 免疫组织化学染色的结果显示,p21Ras 在小鼠着床前的胚胎中呈阳性表达(图略)，阳性细胞染呈深棕色、背底清晰,很易辨认。最早在 4 细胞期，即可观察到 p21Ras 表达阳性的细胞中,阳性物质分布于胞质；而在各期着床前
11、的胚胎中均未检测到 cerbB2 的表达。 3讨论 近年来,国外学者研究发现,着床前小鼠胚胎中,可检测到一些原癌基因的表达1。尽管大量研究证实,原癌基因在一系列已分化的细胞中均有表达并起作用，但它们对着床前胚胎发育的作用仍不清楚。 国外有人报道，在囊胚期的小鼠胚胎中可检测到 ras 基因的表达1,4。本研究中我们采用免疫组织化学方法，发现囊胚期以前的卵裂期胚胎中也有ras 基因的表达，最早可见于 4 细胞期。p21Ras 是相对分子质量(Mr)为 21000的酪氨酸激酶的下游分子。在酪氨酸激酶信号转导途径中，p21Ras 参与蛋白酪氨酸激酶生长因子受体的信号转导，是增殖和分化受体介导的信号转导
12、途径中的重要组成部分。 虽然已明确体细胞的生长分化由多肽生长因子调节，而其在着床前胚胎发育中的作用目前仍不清楚。哺乳类胚胎在无血清及生长因子的化学培养基中能发育至囊胚期，可见外源性生长因子似乎不是着床前胚胎发育所必需的，而加入外源性生长因子则可起促进作用5,6。许多研究认为，胚胎可能产生生长因子(以自分泌方式)并对其发生反应。已发现许多生长因子及其受体在卵裂期胚胎中有表达7，许多生长因子受体(如胰岛素受体、胰岛素样生长因子I 和胰岛素样生长因子受体)均是蛋白酪氨酸激酶，与生长因子结合后而激活。活化受体即发生磷酸化并激活细胞内一系列靶基因，导致信号由细胞表面传导至核内，最终引起基因表达的改变。p
13、21Ras 是 G 蛋白，其作用是将信号从蛋白酪氨酸激酶受体传导至细胞内下游分子：如促有丝分裂原活化蛋白、Raf丝氨酸/苏氨酸激酶、翻译因子 eIF-4 及磷脂酶 C，从而促进细胞增生；也为细胞分化所需的。编码细胞内信号通路基本组件的这一原癌基因在小鼠着床前的胚胎中就有表达。由于这些胚胎也表达蛋白酪氨酸受体，因此，其拥有对多肽生长因子发生反应所需的基本装置。这些生长因子可能是由着床前的胚胎以自分泌方式而产生的，并调节其生长。编码细胞内信号分子的原癌基因在着床前胚胎中的表达，可能为着床时胚胎对子宫产生的生长因子发生反应而作准备。 原癌基因 c-erbB2 是 EGF 受体基因家族中的一个亚型，在
14、各卵裂期小鼠的胚胎中，均未见 c-erbB2 蛋白的表达。研究表明，早期胚胎及子宫中，EGF 家族配受体信号通路对着床十分重要。Lim 等2在孕 18d 的小鼠围着床期子宫中，检测到 c-erbB2 的表达，并认为其对着床前子宫上皮细胞的增生、分化及着床后基质细胞增生，以及蜕膜化过程具有重要的作用。由于在着床前的胚胎中未检测到这一基因的表达，由此我们推测，c-erbB2 对于围着床期子宫生长的变化具有重要的意义，而在着床前的胚胎发育过程中似乎不起作用。 参考文献： 1 Pal SK,Crowell R, Kiessling AA, et al. Expression of proto onco
15、genes in mouse egg and preimplantation embryosJ . Mol Reprod Dev, 1993; 35(1):8 15. 2 Lim H, Dey SK , Das SK. Differentatial expression of the erbB2 gene in the perimplantation mouse uterus: potential mediator of signaling by epidermal growth factor like growth factorsJ . Endocrinology,1997;138(3):1
16、328 1337. 3 Liu HC, Veeck LL, He ZY, et al. Simultaneous detection of multiple gene expression in mouse and human individual preimplantation embrysJ . Fertil Steril,1997； 67(4)： 733 741. 4 Ahmad K, Naz RK. Presence and possible role of c ras and nuclear (c fos and c jun) protooncogene product in preimplantation embryonic development in miceJ . Mol Reprod Dev, 19
