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1、工作原理 Y|-_-2IU 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100g),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用. -O?Q%9v SDS-PAGE 是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. &A 另外样品处理
2、液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.T&ZpP_ 重要参数 (iLo=fd78 聚丙烯酰胺凝胶(PAG) 制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T) 以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: 2l# 6 T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100% &*xjs 其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc) 的重量 ;m=溶液的体积(ml) uUo!kl H L0#p36e 当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝
3、胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: RKB6&r5k 2OJxLmEc 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) rQ9+x6 wj 5105 2-5 LpS)D: xN _#28fOo 分离胶: N%z!bT*E Q. 总体积(ml) 6 3 0d,F0,=v ,#N*RNP 蛋白质的样品制备： FqeRI$P 蛋白质的样品制备是 Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题： Fg8 q 1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 5
4、pQb8TH%- 2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。 t n8 4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂） SxPvLa 5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80中保存，但要注意不要反复冻融。 iZm. XQL 二：需要的溶液： cGKLdZ 裂解液 Laemmli 样品缓冲液 0TGJD$ 5|O 三：操作步骤： u:,O|a7 1)培养细胞蛋白质样品的制备： Go-Wc2 1：胰酶酶解后裂解： /%+
5、r0uE 细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的 PBS 漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450l 裂解液反复吹打。 i2g_4 D 2：皿上直接裂解： X(tt?EiBW 细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的 PBS 漂洗3次，加入450l 裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。 8U/$Ce2 以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S ，功率为100-120W 至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后425000g 离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转
6、置水浴中15S，加入 Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合） ，强力混匀，样品置100水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g 离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。 （样品可立即使用也可以分装冻存，-20存放的样品可稳定保持数月） Q-Y 2)组织样品的制备： cer.$VW 手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培
7、养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer 中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。 ）加入 Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g 离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20 存放的样品可稳定保持数月。 ）=KDbWt 蛋白质的样品制备： Z(4UU 蛋白质的样品制备是 Western Blotting 的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽
8、可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题： kDS1G r* 1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 p.#w,0e& 2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。 K 7sRYkB 3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 YlQEN43 4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂） qtUc( 5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80中保存，但要注意不要反复冻融。 RhT-3H 一：准备工作： 3
9、qAo-ll 一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器 lab#?q35 二：需要的溶液： ?tw % 裂解液 Laemmli 样品缓冲液 %sMghw 三：操作步骤： l-lK(4 1)培养细胞蛋白质样品的制备： !?SlZ3e2 1：胰酶酶解后裂解： IdH8 细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的 PBS 漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450l 裂解液反复吹打。 82#*.0c 2：皿上直接裂解： hM 1N-; 细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的 PBS 漂洗3次，加入450l 裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。 jkR!:R;
10、& 以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S ，功率为100-120W 至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后425000g 离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入 Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合） ，强力混匀，样品置100水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g 离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。 （样品可立即使用也可以分装冻存，-20存放的样品可稳定保持数月） 1Y5Ct 2)组织样品的制备： ng-;iC
11、 手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer 中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。 ）加入 Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g 离心10分钟，取上清液，将其转入另
12、一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20 存放的样品可稳定保持数月。 ） YV, QiTZ #mLqr5 附： SKe2x 0 一：裂解液的制备： vV|Yw1 组织裂解液（全细胞蛋提取）：1：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.4 !: 1fL5 6： PMSF 1 mmoL/L goG:W 7： Aprotinin 1g/ml y CxV 6 8: leupeptin 1g/ml zkCJTa#pt 9: pepstain 1g/ml 79 f|k= 其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。 #Gl-6 dajdj 50 mmoL/L
13、 Tris(PH8.0) IJquXhc 2：RIPA 裂解体系： 150 mmoL/L Nacl IOosZZ+5 1.0%NP-40或 Triton-x-100 fh? 6+ 0.5%脱氧胆酸钠 (ca1 &B9V 0.1%SDS _&;)YBBP 50 mmoL/L Tris( ph8.0) r xbL 4z!%Pfoep 二：Laemmli 样品缓冲液配置（1*SDS 样品缓冲液） bohCEK 50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0） W-Tw8F 100 mmoL/L DTT BGDu.K 2% SDS ,nh?6 0.1% 溴酚蓝 9v,hI ?G0 10% 甘油 q
14、Bq!oV 此液可以配置成不同的储存液，根据蛋白浓度而定，40C 长期保存，用时临时与蛋白液按比例混合，其中 DTT 应临时加入，以防降解。 -NBf8 蛋白质定量 Vj/ 76Ab= ,?WA.D 1)Bradford 法: e0z.9SB 检测原理: Bradford 与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm 检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如 TritonX-100,SDS,NP-40等. n I$k5G Bradford 法浓染液的配制:将100mg 考马斯亮
15、蓝 G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放 4至少6个月保持稳定. ;_,(h5 标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20g -150g/100l 之间绘制标准曲线 . e&6+r& 将待测样本溶于100l 缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用 PBS) Xxn:nB 按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去. (&%+qa 每个样品家5ml 稀释的燃料结合溶液,作用5-30分钟,燃料与蛋白结合
16、 ,将由红色变为兰色,在595nm 波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟. c)H($?+ 首先,将20g 碳酸钠溶于500ml 水中;再将1g CuSO4.5H2O 和2g 酒石酸钠溶于500ml 蒸馏水中;将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存1年以上. jKN5K9 Folin-ciocalteu 酚试剂 ? u5dyr 按体积比1:2:1 将铜/酒石酸/ 碳酸钠,5%SDS 和0.8mmol/l NaOH 溶液混合,室温下储藏,可稳定保存2周,标明为试剂 A e 9P#r 按体积比1:5将 Folin-ciocalteu 酚试剂和 H2O 混合,室温下储存于琥珀色试剂瓶中,可
