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1、第六章 中药含量测定方法,一、薄层色谱法,1、概述,一）薄层色谱法的特点 设备简单，操作方便。 广泛地选用各流动相，比气相色谱灵活。 灵敏度较高 薄层色谱法适于分析小量样品 可以采用多种展开方式：如，双向展开，多次展开，分步展开，连续展开；分离原理是的物理化学原理，例如，吸附色谱，分配色谱，离于交换，薄层电泳，薄层等电聚焦。适于分析热不稳定，难挥发的样品。,（二）方法原理 原理： 薄层色谱分离法是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之 间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。不同物质上升的距离不一样而形成相互分开的斑点从而达到分离。,（
2、三）固定相,（1）硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸性、中性物质分离（可以制备成酸度不同或碱性硅胶扩大使用范围） （2）氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱性、中性物质分离（可以制备成中性或酸性氧化铝扩大使用范围） （3）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、醇类化合物的分离 （4）纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分离亲水性物质 根据制备方法不同，吸附剂又可以分为不同的活性，如：硅胶和氧化铝可以分为五级,2、薄层色谱-可见分光光度法,1）点样：条状，50300ul 2）定位：对照的位置，区带的范围 紫外、荧光、碘蒸气、对照品定位、紫外扫描 3）捕集： 4）洗脱： 渗漉、多次浸出、加热温浸、索
3、氏回流提取 荧光板应洗脱后再比色 5）显色及比色 显色剂用量 反应时间、反应温度 显色稳定性 空白试剂及固定相最好不显色,3、薄层色谱-紫外分光光度法,不需加显色剂 其他同薄层色谱-可见分光光度法,4、薄层色谱扫描法,扫描方式： 反射法：紫外光区 透射法：可见光区 波长选择方式： 单波长法 双波长法：消除背景干扰,注意事项,样品的前处理：溶剂提取 吸附剂的选择：散射系数 点样 光源的选择：钨灯、氘灯、汞灯、氙灯 展开剂的选择 显色剂的选择 双波长法扫描光束的选择：最大吸收和无吸收点波长 扫描方式的选择：线性扫描、锯凿形扫描,5、薄层色谱-发光分析法,胶束增敏荧光法 -环糊精包含增敏作用 鲁米诺
4、（Luminol)等化学发光体系,二、高效液相色谱,第一部分 HPLC概述,2. HPLC的几个重要概念,3. HPLC的特点,4. HPLC的应用对象,1. HPLC的基本描述,HPLC的基本描述,在经典液相柱色谱法基础上发展起来的一种色谱方法,液相柱色谱法原理和气相色谱理论相结合的产物,当今色谱技术中极具活力、发展迅速的的分离分析技术,技术难度较大、不宜熟练掌握、极具挑战性的分离分析方法,HPLC的几个重要概念,HPLC是一种分离方法，有多种分离模式,HPLC是一个连续过程,HPLC是一种“软”的分析方法没有标准图谱可供比对,HPLC是紧密依赖“标准物质”而松散依赖“标准方法”的方法,HP
5、LC是定量分析的巨人，定性分析的“侏儒”,HPLC的特点,高分离度,高速度,高灵敏度,高容量,高灵活性,高效率,作为检测手段,作为制备手段,分离方式众多,应用范围广,HPLC的应用对象,极性大,沸点高,难气化,热稳定性差,易电离,分子量大,有机化合物,通过衍生化反应转变为有机物的无机物,采用特殊分离模式和检测手段亦可分析阴阳离子,HPLC的应用范围,第二部分 HPLC基础理论简介,1. 色谱的基本过程差速移行,2. 色谱的基本方程 VR = VM (1+k),3. 色谱的重要理论塔板理论和速率方程理论,4. 色谱分离的量度a和Rs,5. HPLC高效的理论基础,色谱的基本过程,利用不同物质在两
6、个相（流动相和固定相）之间具有不同的平衡分配系数来进行分离；,不同的平衡分配系数来自于不同的作用力；作用力的不同构成了多种分离模式：,吸附,溶解,离子交换,尺寸排阻,疏水作用,亲和,键合相,手性,物质的化学、物理、物理化学性质上的差异，反映在与固定相和流动相之间作用力上也有所差异色谱分离的基础。,S1,2,S1,S2,S1,S2,M,S,色谱的基本方程,分配系数 K = As / Am,容量因子 k = Ms / Mm,K = k(Vm / Vs),当一个给定溶质的最大值刚刚到达柱子末端时，已有一半的溶质洗脱在一定的体积中(VR)中，其余一半溶质仍然留在柱子中。,按质量平衡原理，VRAm =
7、VmAm + VsAs,两边都除以Am， VR = Vm + Vs (As / Am),= Vm + KVs = Vm(1+k),流动相流速恒定， tR = to (1 + k),塔板理论,理论塔板数 N = 5.54 (tR / W1/2)2,N是反映物质在固定相和流动相中动力学特征的重要参数，是代表一根色谱柱效能的指标。,N保持不变，tR ，W1/2 “一般色谱现象”,理论塔板高度 H = L / N 码书原理,H 的意义？,实际上，色谱中并不存在塔板，是一种理论假设,速率方程理论,涡流扩散,纵向分子扩散,传质阻力,流动相中传质 固定相里流动相中传质固定相中传质,理论塔板高度 H = 2l
8、dp + CdDm/u + (Cm+Csm)dp2u/Dm + Csdf2u/Ds = A + B/u + Cu,Van Deemter 方程,色谱分离的量度a和Rs,N或H仅作为色谱柱效率的量度，但不能衡量在同一根色谱柱上两个物质分离的好坏。,分离系数 a = k2/k1 = tR2/tR1 = VR2/VR1,a代表了两个物质在相同的色谱条件下的分离选择性。,a只是从热力学上表示两物质分离的可能性，直观地看，仅表示两峰相差多远，没有考虑峰的宽度。,由于一般色谱现象的存在，峰宽随着保留时间的延长而增加。峰相距再远，峰太宽，仍然不能分离。,分离度 Rs = 2 (tR2-tR1) / (W2+
9、W1),良好的分离应该是：峰之间有一定的距离，峰形尽量窄。,相邻两个峰，令 W2 = W1 ，则 Rs = (tR2-tR1) / W2,式中：(tR2-tR1) 反映k值的差异，受热力学控制；,W 反映柱效的高低，受动力学影响。,Rs将N和a结合起来，将决定色谱过程的热力学因素和动力学因素综合起来考虑。,达到基线分离的分离度 Rs：1.5,一般分析要求的分离度 Rs 1.25,分离度与实际分离程度之间的关系，与两个峰的相对大小有关,第三部分 HPLC分析方法 的建立和应用,1. HPLC在分析中的地位,2. HPLC分析的内容和要求,3. 产品分析中HPLC模式和仪器配置,4. HPLC耗材
10、的选用,5. HPLC分析过程中的注意点,6. 产品分析中HPLC方法的建立,常用HPLC模式和仪器配置,模式 吸附 键合相 离子交换 尺寸排阻 疏水作用 亲和,色谱柱 C18 C8 Phenyl CN NH2 SiO2 -SO3H,泵 一元 二元 三元 四元,检测器 UV PDA FL RI EC ELSD MSD,HPLC耗材的选用,色谱柱: C18 ，C8柱的通用性,无定型填料柱效低，强度差，寿命短，价格低廉， 如 LiChrosorb RP18，YWG-C18,球形填料 柱效较高，强度高，价格适中，如 LiChrospher C18，Spheresorb ODS，Kromasil C1
11、8,对称性填料柱效高，峰形对称，价格较高，如 Symmetry ODS，,新一代反相柱100水性流动相兼容，耐酸碱性强，价格昂贵，如 Prevail，Platimum,色谱柱的保养装卸、冲洗、贮存,不同品牌、不同规格色谱柱的比较,3-NPA,4-NPA,正、反相键合相色谱的概念,正相键合相色谱 键合相极性强，流动相极性弱，极性弱的物质先出峰,反相键合相色谱 键合相极性弱，流动相极性强，极性强的物质先出峰,键合相极性中等，流动相极性相对于键合相极性的强弱决定键合相色谱的正、反相,反相色谱流动相的选用,纯度：有机溶剂HPLC级；水超纯水； 无机物GR；表面活性剂HPLC级,中性成分：甲醇-水、乙腈
12、-水、四氢呋喃-水 酸乙酸、三氟乙酸、磷酸、高氯酸、正离子对 碱乙二胺、三乙胺、Na2CO3、(NH4)2CO3、负离子对,过滤：有机溶剂 0.5 mm，水性溶液 0.45 mm,脱气：超声波、氦气、在线脱气,某黄酮提取物的色谱图,Impurity,正相色谱流动相的选用,正己烷、庚烷、氯仿,重现性的重要性,通过有限次测定获取准确可靠的结果是企业的追求。,同一份样品溶液重复进样得到再现的谱图是HPLC分析的基本保障。,多次取样，重复测定得到再现的结果是HPLC分析的最终目标。,溶剂的选择 样品溶液的制备（10 ml),流动相最好 流动相的组成部分次之 与流动相混溶的其它溶剂亦可，但最好用流动相或
13、流动相的一个组成部分稀释,假设流动相为50%CH3OH-50%H2O 10 ml 50%CH3OH-50%H2O 如不溶，先用多于5-10 ml CH3OH溶解，再用H2O稀至10 ml 如纯CH3OH也不溶，先用5-10 ml 二氧六环、氯仿、DMF、DMSO等溶剂溶解，再用CH3OH稀至10 ml 对于酸或碱性物质，先用少量碱或酸溶解，再用流动相或水稀至10 ml,o-TA、4-CBP、3-NPA、4-NPA： 直接用流动相溶解或先用CH3OH溶解，再用H2O稀释。 如果流动相中含酸（HAc、HClO4等）， 则H2O中同样应加酸。,甜味剂Aspartame： 用CH3OH- H2O (1
14、:9) 溶解,DSD酸：用Na2CO3溶解，用H2O稀释,叶酸：用氨水溶解,5-硝基-8-羟基喹啉： 用DMSO溶解，再用CH3OH稀释,三苯基氯甲烷： 用CH2Cl2溶解,TPD： 用二氧六环溶解，再用CH3OH稀释,色谱分离模式的确立,以C18柱为例，流动相中有机调节剂设定为甲醇，流速1.0ml/min，紫外检测。,用纯甲醇冲洗色谱柱，进样；,按10的速率降低流动相中甲醇浓度，进样；尽量使所有的峰都在一张色谱图中出现。,lntR = a + bCorg + clnCorg,保留时间随甲醇比例的下降而延长，这样提供了可分离的空间,HPLC方法的建立,氯吡苯脲与 二苯脲的分离,70CH3OH,
15、65CH3OH,60CH3OH,如果上述规律不存在，说明待分析物质不具疏水性，需对流动相进行修饰。,酸性化合物流动相中加酸抑制样品离解 RCOOH RCOO- + H+,碱性化合物流动相中加碱抑制样品离解 R-NH2 +H2O RNH3+ + OH-,离子抑制色谱,如果化合物中同时含有酸性和碱性基团，采用中等pH (6) 的缓冲溶液,阳离子型化合物流动相中加阴离子表面活性剂 M+ + RSO3- RSO3M,阴离子型化合物流动相中加阳离子表面活性剂 X- + R4N+ R4NX,离子对色谱,无论是离子抑制色谱，还是离子对色谱，酸、碱或离子对试剂的浓度都应尽量稀，一般不超过0.1 mol/l，p
16、H值则要在色谱柱的允许范围内。,柱：LiChrosorb RP-18, 5mm, 4.0 i.d. X 150 cm； 流动相：CH3OH-H2O (用H3PO4调节pH=3)，1.0ml/min； 检测波长：254 nm,酸、碱的选择要综合考虑化合物的疏水性和pKa值,H3PO4 pH 2.0,HAc pH 3.5,柱：Kromasil C18, 5mm, 4.0 i.d. X 150 cm； 流动相：CH3OH-H2O (pH=2.0 or 3.5)，1.0ml/min； 检测波长：254 nm,1. Oxalic 2. Tartaric 3. Malic 4. Maleic 5. Succinic 6. Fumaric,六种有机酸的分离,柱
