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1、第六章 凝胶过滤,凝胶过滤（又叫分筛层析）是20世纪60年代发展起来的一种分离纯化方法。 其原理是： 凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物却被排阻在外部; 当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量筛分开了。 凝胶过滤特点：设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等。,常用于： 分离纯化蛋白质(包括酶类)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物； 还可用于: 测定蛋白质的分子质量，样品的浓缩和脱盐等方面。,第一节 凝胶的分类及性质,凝胶是不溶于水但在水中有较大膨胀度和较好分子筛功能的一类化合物。 这化合物目前主要有： 葡聚糖凝胶 天然琼脂糖 交联琼脂糖 其次
2、还有： 聚丙烯酰胺凝胶(生物胶Bio-gel) 交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶 交联琼脂糖与葡聚糖共结合的凝胶 (superdex) 详见表6-1。,一、葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex。 它是由葡聚糖右旋糖酐(G型)和3-氯-1,2环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而成的。 其结构式如图6-1所示。 在交联葡聚糖G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。,1理化性质 葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。 它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。 由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理化性质在水中的有明显的差异：
3、膨胀度(床体积) 吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量) 筛孔的大小 分级范围 葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样，详见表6-2。,以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。 以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。,2稳定性 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。 在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120)消毒0.5h
4、，其性质并不改变。 在0.1molL HCl溶液中浸泡12h，甚至在0.02molL HCI溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。 当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、0.05NaN3或20乙醇等，不然微生物将生长。,3吸附性 葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含1020g当量的羧基基团所致。 羧基基团能与分离物中电荷基团 (尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。 这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克服。 当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。 因此，常用
5、含有NaCl的缓冲液作洗脱液。,新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响(虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子质量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时,需预层析)。 此外；葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集素具有较强的吸附作用， 若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理。,二、琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中分离出来的。 在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除去，得到不带电荷基团的琼脂糖。 琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链。 这种多糖链在100左右时呈液态
6、，当温度下降到45以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。,该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力，在pH4.09.0的缓冲液中是稳定的。 琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶。 琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。 琼脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose 2B(2)、4B(4)和6B(6)。 Sepharose 6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B。,Sepharose与1，3-二溴异丙醇(1，3-dibromopropano1)在强
7、碱性条件下反应后，即生成CL-型交联琼脂糖。 这种琼脂糖的筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，但热稳定性和化学稳定性都有了提高。 CL-型交联琼脂糖可在广范围的pH溶液(pH314)中使用，即使用较强的碱溶液短时间处理，其性能也不会改变， 但是，在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚。 琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好。正如前章所述，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。 琼脂糖凝胶的有关性质见表6-1和表6-3。,三、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio-gel。 它是以甲撑双丙烯酰胺(双体)作交联剂，以过硫酸铵作催化剂， 在N,N,N,N,- 四甲基乙二胺
8、(TEMED)加速剂的作用下， 将丙烯酰胺(单体)聚合而成的。 当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。,商品聚丙烯酰胺凝胶型号有Bio-gel P-2到P-300，其阿拉伯数字相当于排阻限度的10-3。 一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀。 该凝胶不溶于水和普通有机溶剂，能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡； 在pH110或短时间超过此pH范围的溶液中较稳定，要避免长期与强酸和强碱接触。 聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，如使用离子强度略高的洗脱液操作，此弊病可以克服。 聚丙烯酰胺凝胶的物理性质见表6-4。,四、Sephacryl
9、 Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联制成的。 属硬性凝胶，具有筛孔和少量的羧基基团。 Sephacryl吸水时，其珠状颗粒直径为25-75um(见表6-5)。 通常是用于水相系统中。 若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。,它在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少； 它可在pH211范围内使用，当pH低时，葡聚糖链将发生少许水解作用； 在0.2molL NaOH溶液中(室温)处理100h，对其低流速和多孔性没有明显影响。 用去污剂(如SDS)、6molL盐酸胍和8molL尿素溶液可作为洗脱剂， 高温(120)消毒(pH7.0时)处理后，层析性质没有明显变化。 Sep
10、hacryl能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖(proteoglycans)，甚至大的病毒颗粒(直径300-400nm)也可用它分离。 层析时，用细颗粒凝胶分辨率高,五、Superdex Superdex是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成的。 该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学稳定性。 在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度可在pH312范围内变化，溶液中加入去污剂(如1SDS)和(或)解离剂(如8molL尿素、6molL盐酸胍)时，也不会影响分离效果。 此凝胶共有6种类型，详见表6-6,除上述5类凝胶外，还有： Superose(高交联度的多孔琼脂糖珠，有制备级和分析级)、 玻璃
11、珠 聚苯乙烯凝胶 等也具有分子筛功能。 玻璃珠 有大量的网孔，且分布均一; 它机械性能良好，在较高的层析流速下，分辨率并不受影响; 缺点是对蛋白质等物质有吸附能力。,第二节 基本原理,凝胶过滤层析的基质: 具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。 排阻、扩散效应（见下图） 这种基质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外， 而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自由地扩散、渗透。 任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围均在0100之间。,分配系数Kav 用分配系数Kav表示被排阻的程度；即：分离化合物分配在内水和外水体积中的比例关系。 Kav值的大小依赖于凝胶床
12、的总体积(Vt)、外水体积(V0)以及分离物本身的洗脱体积(Ve)。即: Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo） 在限定的层析条件下， Vt和Vo都为恒定值， Ve值是随着分离物分子质量的变化而变化的。 分离物分子质量大，Kav值小； 反之，Kav值增大。,分离过程 在同一凝胶过滤柱上分子质量不同的混合物质，由于流动相的作用，这些物质将发生排阻和扩散效应。 若缓冲液连续倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续发生； 结果是分子质量大的物质先从柱中流出， 分子质量小的物质则后从柱中流出。 (见图6-2) 流出物分管等量或等时地收集， 检测后分段合并相同组分的各管流出物，把分子质量不同的物质相互
13、筛分开了。,筛分效果 受操作条件的影响(如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等)； 更为直接的影响是Kav值的差异性。 Kav值差异性大，分离效果好； Kav值差异性小，乃至等于1或等于零(即使样品中各组分的分子质量相差很大)，则分离效果很差，或根本不能分开。,Kav值的计算 从公式Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）看出， 只要测出：床体积Vt 外水体积Vo 洗脱体积Ve 即可计算出Kav值。,凝胶床总体积Vt的求得 有如下2种方法可求得Vt I.计算法 根据层析柱体积计算总体积，可用下列公式表示 Vt =r2h 式中, r为层析柱半径； h为凝胶床
14、高度； 为圆周率。,II.测量法 已知，床体积Vt Vt=Vo+Vi+Vg 因Vg与Vt相比是很小的，可忽略不计，故 Vt=Vo+Vi Vo和Vi可以通过实验测得(见图6-3)，如下：,通过实验求Vo和Vi 当把分子质量不同的混合溶液铺在凝胶床上时， 溶液中的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中。 凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水体积Vo， 即: Ve=Vo (Kav=0) 溶液中的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内； 凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积, 即: Ve=Vt=Vo+Vi (Kav=1) 则: Vi=Ve-Vo 溶液中的分子大小介于
15、凝胶孔径上限和下限之间者，则有一部分能进入凝胶网孔，故其洗脱体积 Ve是在Vo和Vt之间(Kav在01之间)。,实践中 测定外水体积（Vo） 通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。 理由是： 该物质分子质量大(为200万)，呈蓝色， 在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻， 并可借助本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测(在210nm或260nm、620nm)洗脱体积Ve，即 Ve = Vo 测定内水体积(Vi) 可选用硫酸铵、N乙酰酪氨酸乙酯，或者其他与凝胶无吸附力的小分子物质。即： Vi = Ve - Vo,洗脱体积Ve 分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者的洗脱体积Ve也是通过实
16、验测得。 故可求得某一分离物的Kav值=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）。 分离物在凝胶过滤层析时的行为，除用Kav和Kd表示外，还可用VeVo或VoVe(R值)表示。这些值的大小见图6-3。,第三节 操 作,一、凝胶的选择和处理 1凝胶的选择 (1)型号 凝胶型号多。型号不同，筛分范围亦不相同。 Sephadex G型一般适宜于分离蛋白质。 蛋白质脱盐时，可选用凝胶SephadexG-25。 一般来说， 在规定的筛分范围内，混合物之间分子质量差别越大，分离的效果越好。,(2)粒度 凝胶的粒度有粗有细(与交联度无关)。 细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均一，因此分离效果较粗得好 (见图6-4)。 但细颗粒凝胶流速慢，故宜用大直径的层析柱，这类凝胶用于小型
