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1、第九章 血清学反应,第一节 概 述,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,2,一 血清学反应的概念及一般特点,抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特异性结合，在体外结合能发生可见免疫反应。由于抗体主要存在于血清中，故称为血清学反应。 血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与反应物质，则表现出反应有多种多样。其反应的一般特点是：,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,3,（一）特异性和交叉性 血清学反应具有高度特异性。由于抗原决定簇的组成、结构以及排列不同，所诱导产生的抗体也不同。抗原只能与相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。 生物体的组成是复杂的，包含有多种抗原成分，在进化过
2、程中形成不同的种类，有各不相同的特异性抗原，在亲缘种系中往往含有部分相同的抗原成分，能引起交叉反应。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,4,（二）结合的可逆性 抗原抗体结合是分子表面结合，这一结合受理化因素的影响，当温度超过60C或pH降至3以下时，则抗原抗体复合物又重新离群。离群后的抗原、抗体，其理化性质、免疫活性保留。利用抗原抗体结合的可逆性，可进行免疫吸附层析，纯化抗原或抗体。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,5,（三）最适比与带现象 抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现可见反应。当抗原抗体比例适当时，两者结合后，尚有未饱和的结合点，可以继续与游离的抗体、抗
3、原或与抗原抗体的结合物的未饱和点相联结，逐渐形成愈来愈大的复合物，出现了肉眼可见反应。比例最适合，出现反应最快，反应产物愈多。 如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合，不出现可见反应，谓之区带现象或带现象。为了避免血清学反应的带现象，需要将抗原或抗体作适当的稀释。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,6,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,7,比例不适合不能完成第二步反应 带现象,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,8,（四）反应的阶段性 抗原与抗体进行结合，可分为两个阶段： 第一阶段为抗原
4、与抗体的特异性结合阶段，反应快，几秒钟至几分钟即完成，但无可见反应； 第二阶段为抗原与抗体的反应可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合等，反应进行较慢，需几分钟或更久。第二阶段受电解质、温度、pH值等影响。两个阶段在反应进行中无严格界限。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,9,（五）影响反应的因素 1.电解质 血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作时，一般用生理盐水或8%10%高渗盐水作稀释，才出现较强反应。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,10,2.温度 温度升高，可增加抗原与抗体分子运动而碰撞接触，加速反应的出现，故通常将抗原
5、抗体混合后，放置37C温箱或水浴箱中，保持一定时间，促进反应。温度高，加速反应；温度低，反应时间延长，但反应结合充分，故在补体结合反应、免疫吸附实验中，采用的低温中放置过夜。 3.酸碱度 血清学反应通常用pH68，过酸或过碱都可使复合物离群，pH值在等电点时，可引起非特异凝集。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,11,二 血清学反应的类型和参与成分 (见课本表9-1) 三 血清学反应的应用方式和目的,抗原抗体反应是特异性的，在应用时必须有一个是已知的，通过反应来鉴定另一个未知的。例如鉴定某一病原微生物时，多用已知抗体。诊断传染病时，对慢性病可用已知的抗原检测未知的特异性抗体；诊断
6、急性病则用已知的抗体检测未知的抗原（病原），如炭疽病等。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,12,（一）抗原与抗体的快速检测 在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿瘤、自身免疫疾病时，均已广泛应用血清学方法检查抗体或抗原（细菌、病毒）的存在，作为诊断疾病的手段。现已应用的间接血凝技术、对流电泳、标记抗体技术，均能快速、简便的确诊抗原或抗体。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,13,（二）生物活性物质的超微定量 应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术，抗原抗体检测的敏感度均大为提高，已达到能精确测出Pg的水平，其敏感度已大大超过了常规的化学分析。此类技术已应用于测定动物体
7、内的激素、维生素、药物及其他病理过程中的微量产物。 （三）抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定位 用荧光抗体、酶标抗体技术，可以检测病毒或细菌在动物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组化法及铁蛋白标记技术进行免疫电镜观察，可以测定病毒在亚细胞水平的定位，也可测定淋巴细胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此可分析传染病发生的机制及对免疫机理的探讨。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,14,（四）微生物的鉴定与分析 应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、沉淀实验等血清学实验，进行微生物的鉴定及区别微生物的血清型，从而确定微生物的类型及其亲缘关系。还可应用琼脂扩散实验、免疫电泳等技术，对微生物的抗
8、原组分进行分析。 （五）血型鉴定 用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、溶血实验、Coomb实验等技术，可作血型鉴定、亲子关系的确定、新生儿和出生幼畜溶血病的诊断。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,15,第二节 沉淀试验,可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的絮状白色沉淀，称之为沉淀试验。 可溶性抗原 + 免疫血清 出现沉淀现象 (病毒等) （抗体） 比例适合 沉淀原 沉淀素 比例不适合 无沉淀现象 容易过多 前带现象,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,16,一 液相沉淀试验 1环状沉淀试验 原理：小试管内，下层沉 淀素与上层沉淀原 在液界面应形
9、成白 色沉淀环。 用途：检测皮毛中的炭疽 杆菌抗原（Ascoli试验） 2絮状沉淀试验 抗原与抗体在试管内混合，在电解质的存在下抗原抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒素和抗毒素测定。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,17,二 琼脂扩散试验,琼脂是一种含有硫酸基的多糖，加热溶解于水，冷却后凝固成凝胶，琼脂凝胶是一种多孔结构，其孔径大小与琼脂含量有关，1%琼脂凝胶孔径为85nm，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两者结合形成沉淀线。沉淀线的位置与抗原、抗体颗粒的大小、浓度，沉淀线的数目和所含抗原组分有关。琼脂扩散可分为单扩散（抗原
10、或抗体中一种成分扩散）和双扩散。 根据其扩散的方向可分为单向单扩、单向双扩、双向单扩、双向双扩，其中双向双扩应用最广。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,18,1 单向单扩散,亦称Oudin。将0.6%-1%琼脂加热熔化后，加入定量经预热的稀释抗血清，混合均匀后，加入小试管中，待凝固后加入0.5ml抗原于其上，直立，置于37C中，2-3h后出现沉淀线。由于抗原的扩散，使沉淀线不断向下推移，而最初形成的沉淀带随抗原的扩散而向下推移，最后稳定。沉淀带距抗原愈近，其浓度愈大，可作抗原浓度测定。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,19,2 单向双扩散 亦称Oakley。基本
11、作法同上，但在抗原与抗体之间加一层不含抗体的盐水琼脂，抗原与抗体均向中间琼脂扩散，形成沉淀带。主要用于抗原成分的分析。 3 双向单扩散 亦称辐射扩散。在平皿或玻板上进行。用2%缓冲琼脂盐水，加热融化，待冷后加入经预热的抗血清（用1：5-10倍稀释），混合后倒入平皿或玻板上，厚2-3mm。凝固后在凝胶板上打孔，孔径2-3mm，孔内滴加抗原液，放置湿盒中37C下扩散。抗原在孔内向四周扩散，与凝胶中的抗体接触，形成白色沉淀环，白环的大小随抗原的浓度而增大。此法在兽医临床上用于蛋白质定量实验。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,20,4双向琼脂扩散（琼扩） 此法系采用1%琼脂倒于平皿或玻
12、片上，制成凝胶板，可 按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在 37C湿箱中24-72h后观察。在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每 一种抗原成分出现一条沉淀带。 结果判断： 如两个相邻孔之间抗原 相同，则沉淀带融合；抗 原则不同，则互相交叉； 部分相同则部分融合， 另外不同部分则交叉。 特点：简便、敏感性低、耗时、应用最广 用途：常用于细菌、病毒的鉴定，抗血清效价的测定，抗原组分的分析及传染病的诊断等，如马传染性贫血病的诊断。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,21,三、 免疫电泳,琼脂扩散与电泳技术结合起来称免疫电泳。由于抗原颗粒带电荷不同，在同一电场中其泳动速度不同，
13、故起迁移率不同，因而通过电泳可将抗原成分分开。停止电泳后加抗血清进行扩散，如有一队抗原抗体出现一条沉淀线，因而大大加强了免疫扩散的分辨率及敏感性。此法可应用于抗原成分及含量成分的分析、免疫球蛋白纯度的鉴定，以及传染病的快速诊断等。 1微量免疫电泳 用pH8.6的巴比妥缓冲液（VB液）配成1%的琼脂液，制成凝胶板。在凝胶板1/3处打孔2个，孔径2-3mm，两孔间距10-12mm。孔内滴加抗原，置于电泳槽上，两端用滤纸或纱布做桥，连接电泳液。电泳时，按凝胶板宽度测电流，电泳45min-2h。电泳完毕，滴加抗血清，进行扩散。抗原成分不同，泳动速度不同，与抗血清形成数条清晰的沉淀弧。本法用于血清成分分
14、析及提取的Ig纯度鉴定。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,22,正常人血清蛋白的免疫图象,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,23,2对流免疫电泳 试验时在凝胶板上打孔，两孔为一组，并排打孔两组，然后加样。抗原滴入负极端孔内，抗体滴入正极端孔内，进行电泳。泳动30-90min，观察结果。在两孔之间出现沉淀带，为阳性反应。 结果判断： Ag Ab 特点：反应时间短，敏感性提高 用途：定性，已不多用（水貂阿留申病，以病原Ag检测病貂血清中的抗体）,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,24,3火箭电泳 将双向单扩散与电泳技术结合起来，其沉淀线似火箭，故称火箭电
15、泳。 本法将琼脂融化、冷却，在融化的琼脂中加入一定量的已知抗血清，制成凝胶板。在其一端打一小列孔，分别在孔中加入待检抗原或已知抗原，放置电泳槽中，加样品端位于负极，用双层滤纸连接琼脂板的槽内缓冲液，接通电源，板端电压4V/cm，电流3mA/cm，电泳2-10h。电泳后，抗原在有抗血清琼脂板内向正极迁移，前端与抗体接触，形成火箭状况沉淀弧。在同一抗体浓度下形成峰的高低，与抗原浓度大小成正比。本法用于抗原量的测定（先用已知抗原浓度测定制成曲线）。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,25,火箭电泳图 为标本；为标准抗原,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,26,第三节 凝集
16、试验,细菌、红细胞等颗粒状态的抗原与相应的抗体结合后，在电解质存在时相互凝集成絮片状团块，这种试验称为凝集试验（Agglutiation test）。 参与反应的抗原叫凝集原；参与反应的抗体称为凝集素，主要有IgG、IgM。凝集实验有直接凝集试验和间接凝集试验两种。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,27,基本原理： 生理盐水 颗粒性抗原 + 相应抗血清 抗原颗粒凝集 (细菌、红细胞) 比例适合 凝集原 凝集素 过多 后带现象 （稀释血清） 一、直接凝集试验 颗粒性抗原与相应抗体在电解质的参与下，直接结合，凝集成团的现象，称直接凝集试验。按其操作方法可分为玻片发和试管法。,2019/1/12,兽医微生物学及免疫学课程组,28,1玻片凝集试验 将已知的抗血清1-2滴，滴于清洁玻片上，取待检菌液（抗原）加于其上，混合均匀，数分钟后可出现颗粒状或絮片状凝集，谓之阳性反应。 特
