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1、第七章：微生物的生长繁殖及其控制（3学时）,通过本章的学习，要求掌握： 1、微生物生长量的测定方式。 2、细菌纯培养生长曲线各个时期的主要特点。 3、物理、化学手段用于控制微生物生长的方法及原理。 重点： 细菌纯培养生长曲线。 难点： 如何利用细菌纯培养生长曲线的对数生长期来计算细菌的代时和代数。,第一节 微生物生长的测定,第二节 细菌的群体生长繁殖,第三节 微生物生长繁殖的控制,微生物生长的概念（与动植物生长概念的差别） 微生物生长的常规测定方法（原理和操作）,细菌生长繁殖的规律（标准生长曲线） 及控制技术（连续培养的概念与方法）,各种物理、化学因素对微生物生长的影响（方法原理）,二. 以数
2、量变化对微生物生长情况进行测定,三. 以生物量为指标测定微生物的生长,一. 微生物生长概述,要求：掌握微生物生长的概念及常规测定方法 （原理和操作）,第一节 微生物生长的测定,生长growth：有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。 表现为细胞质的量不断增加，体积加大。 繁殖reproduction由于细胞分裂而引起的个体数目的增加。 单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。 多细胞微生物（如某些霉菌）细胞数目的增加（菌丝细胞的不断延长或分裂）如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长。只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做繁殖。,一般情况下，当环境条件适合时，生长与繁
3、殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是发育development。,一. 微生物生长概述,微生物在自然界总是混杂地生活在一起，要想研究某一种微生物，必须把研究对象从混杂群体中分离出来。,获得纯培养的方法 稀释倒平板法pour plate method 涂布平板法spread plate method 平板划线分离法streak plate method 利用选择培养基分离 单细胞（单孢子）分离法,纯培养技术,纯培养(pure culture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.,1、稀释倒平板法,2、涂布平板法,操作较麻烦，
4、对 好氧菌、热敏感 菌效果不好！,使用较多的常规 方法，但有时涂 布不均匀！,3、平板划线分离法（Streak Plate）,特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）,4、选择培养分离,抑制大多数其它微生物的生长，使待分离的微生物生长更快, 数量上升,直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离 富集培养,利用选择培养基分离 根据所要分离的菌种的特性选用培养基： 分离真菌用马丁氏培养基，pH偏酸； 分离
5、放线菌用高氏1号，pH中性偏碱。 根据不同菌对化学试剂的敏感性： 分离放线菌，培养基中加10%酚，抑制细菌、真菌； 从土壤中分离真菌，加链霉素，抑制细菌生长。 根据分离对象的营养特征： 分离能发酵纤维素的菌株，培养基以纤维素为唯一碳源。 分离固氮菌，用无氮培养基。,5、单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法在显微镜下从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适于较大微生物 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,第一节 微生物生长的
6、测定,二. 以数量变化对微生物生长情况进行测定,1、培养平板计数法,2、膜过滤培养法,3、显微镜直接计数法,三. 以生物量为指标测定微生物的生长,1、比浊法,2、重量法,3、 生理指标法,在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长。,1、培养平板计数法,二. 以数量变化对微生物生长情况进行测定,测定微生物的活菌数viable count 稀释平板测数法dilute plate count 以CFU(colony forming units)表示,稀释培养测数法（又称最大概率法，MPN most probable number）（参见实验教材）,2、膜过滤培养法测定含菌较少的空气和水中的微生物
7、数目,水中的细菌总数：124个/100 ml,将定量的样品通过滤膜过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,菌数低的样品（如水） 膜过滤 培养 菌落计数,（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定,3、显微镜 直接计数法,采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。,缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察。,三. 以生物量为指标测定微生物的生长,1、比浊法 在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越
8、多，光密度越大。因此，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反映菌液的浓度。,2、重量法 细胞干重测定：单位体积的培养液中的微生物细胞的干重。,3、 生理指标法 总氮量：用化学分析方法测出微生物细胞中蛋白质或氮元素的含量。 DNA含量：用荧光法测定微生物细胞中DNA含量。 代谢活性：根据微生物生命活动的强度来估算生物量。 如单位体积培养物在单位时间内的O2消耗、糖消耗或产酸产CO2量等。,特点：快速、简便；但易受干扰。,细菌生长繁殖的规律（标准生长曲线） 及控制技术（连续培养的概念与方法）,第二节 细菌的群体生长繁殖,一、生长曲线,一条典型的生长曲线至少可以分为 迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等
9、四个生长时期,迟缓期lag phase （滞留适应期） 菌种初接入新鲜培养液内，微生物细胞需要通过自身生理机能的调节逐步适应新环境。表现为细胞数量不增加了但细胞个体体积增大，代谢活跃,菌种 ： 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短 菌龄 ： 用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期 接种量：一般 接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量） 培养基成分： 在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短； 接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延迟期长短的因素：,认识延迟
10、期的特点及原因对实践的指导意义：,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期； 采取的缩短lag phase 的措施有： 增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。 选用繁殖快的菌种 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,对数期logarithmic growth phase 细菌生长旺盛，代谢活力强。分裂速度快，菌数以指数级数增加，代时稳定。,应用意义： 由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳菌龄； 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理代谢及遗传研究或进行染
11、色、形态观察等的良好材料。,在对数生长期内，细菌数目的增加是按指数级数增加的，即 20 2 1 22 23 2n 这里的指数 n 为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一个细菌繁殖n代产生2n 个细菌。 如果在对数期开始时间 t1的菌数为 x1 ，繁殖 n 代后到对数期后期t2的菌数为 x2，则 代时(Generation time，G) （即每增加一代所需要的时间） G=（t2 - t1）/n 先求代数n 由于x2 = x1 2n lgx2 = lgx1 + nlg2 ； n=（lgx2 - lgx1）/lg2 n = 3.3 lg (x2 /x1 ) G =（t2 - t1 ）/3.3 l
12、g (x2 /x1),例如：在一细菌培养液中第一次测得的细菌数为 104 /ml，经过培养 4 h后，又测得菌液中的细菌数为 108 /ml，求此菌的世代时间和在此时间内繁殖的代数。 根据公式：G = （t2 - t1 ）/3.3 lg (x2 /x1) t2 - t1 = （4 - 0） 60 min = 240 min x2 = 108 x1 = 104 lg(x2 /x1 ) = lg108 lg104 = 8 - 4 = 4 代入上式 G = 240/3.3 4 = 240/13.2 = 18 min 即在上述培养液中，世代时间为 18 min。 细菌繁殖代数 n = (t2 - t1
13、)/G = 240/18 = 13.3 繁代。,稳定期(stationary phase) 又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度，又逐渐趋向零。 在一定容积的培养基中，细菌为什么不能按对数期的高速率无限生长呢? 这是由于对数期细菌活跃生长引起周围环境条件条件发生了一系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸如pH、氧化还原电位、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂。,稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌
14、体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数量最高。 这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。 稳定期的微生物，在数量上达到了最高水平，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。,应用意义： 1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。,衰亡期(decline phase) 细菌死亡率逐渐增加，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”。其中有一段时间，活菌数呈几何级数下降，故有人称之为“对数死亡阶段”。 这
15、一阶段的细胞，有的开始自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。,不是所有细胞均处于完全相同的生理状态，因此，在细菌生长的整个周期，细菌数和培养时间，往往是一条缓慢上升以后又逐渐下降的曲线。 认识和掌握细菌生长曲线，对发酵生产的指导意义： 1）计算生长速率和代时； 2）不同生长期的细胞在结构和生理上可能有很大差别，了解生长曲线，就能根据需要进取样和收获； 3）不同的生长期理化因子对微生物的影响可能不同。对数生长期的细胞较为一致，因此常用于研究细胞的新陈代谢。,三、连
16、续培养（continuous culture）,分批培养（batch culture） ：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。 连续培养（continuous culture） ：在微生物培养的过程中，不断供给新鲜的营养液，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期。 连续培养理论基础：基于对典型生长曲线中稳定期形成原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出连续培养技术。,原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,连续培养原理,概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。 原理：调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变, 即浊度不变
