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1、2019/1/6,1,实验一 -半乳糖苷酶的诱导合成,2019/1/6,2,一.实验原理,大肠杆菌细胞在培养过程中，添加诱导剂（乳糖或其他半乳糖），能迅速诱导半乳糖苷酶的合成。该酶的诱导合成受葡萄糖的阻遏，称为分解代谢物阻遏， 而环腺苷酶（cAMP）可使分解代谢物阻遏作用解除。,2019/1/6,3,2019/1/6,4,2019/1/6,5,试剂和材料,1）大肠杆菌菌株。 2）营养肉汤培养基：蛋白胨5，牛肉膏3，NaCl 5，pH7。 3）0.1mol/L葡萄糖溶液。 4）0.1mol/L乳糖溶液。 5）cAMP钠盐溶液：配成0.1mol/L。 6）甲苯。 7）邻-硝基酚-D半乳糖苷（ONP
2、G）溶液：称取40 mg ONPG，溶解于100 ml，pH 7.4，0.1mol/L磷酸缓冲液中。 8）0.1mol/L，pH7.4磷酸缓冲液。 9）水浴恒温振荡器。 10）恒温水浴槽。 11）分光光度计。,2019/1/6,6,操作方法,1.将5培养过夜的大肠杆菌种子液接种于40ml营养肉汤培养基中，于37振荡培养。 2.当OD550达0.3左右时（约40min），分装到4根L-试管中，每管8.5ml培养液。 （记得标上编号）,2019/1/6,7,2）4根L-试管分别添加：, 1.5ml无菌水 （建议标编号：A 1，2，3，4） 0.5 ml乳糖溶液和1 ml 无菌水； 0.5 ml乳糖
3、溶液，0.5 ml葡萄糖溶液和 0.5 ml无菌水； 乳糖溶液.葡萄糖溶液和cAMP-Na溶液各 0.5ml。,2019/1/6,8,3）将4根L-试管同时于37振荡培养，每隔20 min，分别取出2 ml培养液于小试管中，各加一滴甲苯，于37振荡30 min置冰箱以备酶活力测定。 （记得标上编号）,2019/1/6,9,4.B- 半乳糖苷酶的活力测定：,取上述甲苯处理的细胞悬浮液,各取1.5mL，分别加入3 ml ONPG溶液作为底物，于30反应10 min分别测定反应前后的OD420 (若OD1.0,则需稀释）,2019/1/6,10,在420 nm波长下，按上述条件测定的光密度每变化0.
4、001定义为酶的一个活力单位，即： 酶活力（单位）OD4201000,2019/1/6,11,思考题：,1.本实验的原理是什么？试分析，不同组别添加物对半乳糖苷酶合成的影响。 2.试分析实验的结果和理论结果的差异，试分析其原因。,2019/1/6,12,2019/1/6,13,2019/1/6,14,2019/1/6,15,2019/1/6,16,2019/1/6,17,2019/1/6,18,2019/1/6,19,2019/1/6,20,2019/1/6,21,2019/1/6,22,2019/1/6,23,2019/1/6,24,2019/1/6,25,2019/1/6,26,2019/
5、1/6,27,一、操纵子(operon),细菌能随环境的变化，迅速改变某些基因表达的状态，这就是很好的基因表达调控的实验模型。人们就是从研究这种现象开始，打开认识基因表达调控分子机理的窗口的。,2019/1/6,28,1.操纵子的提出,大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先利用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间的适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长。,2019/1/6,29,大肠杆菌利用乳糖至少需要两个酶：促使乳糖进入细菌的半乳糖透过酶(lactose permease)和催化乳糖分解第一步的 半乳糖苷酶(
6、 -galactosidase)。,2019/1/6,30,在环境中没有乳糖或其他 -半乳糖苷时，大肠杆菌合成 -半乳糖苷酶量极少，加入乳糖2-3分钟后，细菌大量合成 -半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一碳源时，菌体内的 -半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的3%。 在上述二阶段生长细菌利用乳糖再次繁殖前，也能测出细菌中 -半乳糖苷酶活性显著增高的过程。,2019/1/6,31,这种典型的诱导现象，是研究基因表达调控极好的模型。针对大肠杆菌利用乳糖的适应现象，法国的Jocob和Monod等人做了一系列遗传学和生化学研究实验，于1961年提出乳糖操纵子（lac operon）学说。,2
7、019/1/6,32,2. 操纵子的基本组成,乳糖操纵子模型已被许多研究实验所证实，对其有了更深入的认识，并且发现其他原核生物基因调控也有类似的操纵子组织，操纵子是原核基因表达调控的一种重要的组织形式，大肠杆菌的基因多数以操纵子的形式组成基因表达调控的单元。 下面就以乳糖操纵子为例子说明操纵子的最基本的组成元件（elements）。,2019/1/6,33,(1) 结构基因群,操纵子中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(structural gene, SG)。一个操纵子中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放阅读框(open reading frame),
8、5端有起始密码ATG，3端有终止密码TAA、TGA或TAG。各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。,2019/1/6,34,至少在第一个结构基因5侧具有核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)，因而当这段含多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA，就能被核糖体所识别结合、并起始翻译。核糖体沿mRNA移动，在合成完第一个编码的多肽后，核糖体可以不脱离mRNA而继续翻译合成下一个基因编码的多肽，直至合成完这条多顺反子mRNA所编码的全部多肽。,2019/1/6,35,乳糖操纵子含有、和3个结构基因。 基因长3510bp，编码含1170个氨基酸、分子量为13
9、5,000的多肽，以四聚体形式组成有活性的-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)，再分解为半乳糖和葡萄糖；,2019/1/6,36,基因长780bp，编码有260个氨基酸、分子量为30,000的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌； 基因长825bp，编码275氨基酸、分子量为32,000的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。,2019/1/6,37,基因5侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（RBS）特征的Shine-Dalgarno(SD)序列，因而当乳糖操纵子开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA上。 由于、三个基因头尾相接，上一个基因的翻译终止密码靠近
10、下一个基因的,2019/1/6,38,翻译起始密码，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。,2019/1/6,39,2019/1/6,40,(2) 启动子,启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5侧上游，控制整个结构基因群的转录。 用RNA聚合酶与分离的一段DNA双链混合，再加入外切核酸酶去水解DNA，结果只有
11、被RNA聚合酶识别结合而被保护的那段DNA不被水解，由此可以测出启动子的范围及其序列。,2019/1/6,41,虽然不同的启动子序列有所不同，但比较已经研究过的上百种原核生物的启动子的序列，发现有一些共同的规律，它们一般长40-60bp，含A-T bp较多，某些段落很相似的，有保守性，称为共有性序列(consensus sequences)。 启动子一般可分为识别(R，recognition)、结合(B，binding)和起始(I，initiation)三个区段。,2019/1/6,42,转录起始第一个碱基（通常标记位置为+1）最常见的是A；在-10bp附近有TATAAT一组共有序列，因为这段
12、共有序列是Pribnow首先发现的，称为Pribnow盒（Pribnow box）；在-35bp处又有TTGACA一组共有序列。,2019/1/6,43,2019/1/6,44,不同的启动子序列不同，与RNA聚合酶的亲和力不同、启动转录的频率高低不同，即不同的启动子起动基因转录的强弱不同，例如：PL、PR、PT7属强启动子，而Plac则是较弱的启动子。,2019/1/6,45,(3) 操纵区,操纵区（operator）是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵子序列上，会影响其下游基因转录的强弱。,2019/1/6,46,以前将操纵区称为
13、操纵基因（operator gene）。但现在基因定义是为蛋白质或RNA编码的核酸序列，而操纵序列并不是编码蛋白质的基因，却是起着调控基因表达强弱的作用，正如启动序列不叫启动基因而称为启动子一样，操纵序列就可称为操纵区。operon译为操纵子，即基因表达操纵的单元之意。,2019/1/6,47,以乳糖操纵子中的操纵区为例，其操纵区（o）序列位于启动子（p）与被调控的基因之间，部分序列与启动子序列重叠。 仔细分析操纵区序列，可见这段双链DNA具有回文（palindrome）样的对称性一级结构，能形成十字形的茎环（stem loop）构造。不少操纵区都具有类似的对称性序列，可能与特定蛋白质的结合相
14、关。,2019/1/6,48,阻遏蛋白与操纵区结合，就妨碍了RNA聚合酶与启动子的结合及其后 -半乳糖苷酶等基因的转录起始，从而阻遏了这群基因的表达。 最早只把与阻遏蛋白结合、起阻遏作用的序列称为操纵区，但其后发现有的操纵子中,2019/1/6,49,同一操纵序列与不同构像的蛋白质结合，可以分别起阻遏或激活基因表达的作用，阿拉伯糖操纵子中的操纵序列就是典型的例子。因而凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列，不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放，都可称为操纵区。,2019/1/6,50,（4） 调控基因,调控基因(regulatory gene)是编码能与操纵序列结合的调
15、控蛋白的基因。调控蛋白有： 阻遏蛋白(repressive protein)：与操纵区结合后能减弱或阻止其调控的基因转录，其介导的调控方式为负调控(negative regulation)；,2019/1/6,51,激活蛋白(activating protein)：与操纵区结合后能增强或起动其调控的基因转录，所介导的调控方式为正调控(positive regulation)。,2019/1/6,52,某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，这些特定物质可称为效应物（effector）。有两种： 诱导剂(inducer)：能引起诱导发生的分子；
16、阻遏剂或辅助阻遏剂(corepressor)：能导致阻遏发生的分子。,2019/1/6,53,例如在乳糖操纵子中，调控基因lac I位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R。 在环境没有乳糖存在的情况下，R形成分子量为152,000的活性四聚体，能特异性与操纵区紧密结合，从而阻止利用乳糖的酶类基因的转录，所以R是乳糖操纵子的阻遏蛋白；,2019/1/6,54,当环境中有足够的乳糖时，乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵区特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。 在这过程中乳糖就是诱导剂，与R结合起到去阻遏作用(derepression)，诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放。,2019/1/6,55,许多调控蛋白都是变构蛋白（allosteric p
