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1、2019/1/6,1,实验一 -半乳糖苷酶的诱导合成,2019/1/6,2,一.实验原理,大肠杆菌细胞在培养过程中,添加诱导剂(乳糖或其他半乳糖),能迅速诱导半乳糖苷酶的合成。该酶的诱导合成受葡萄糖的阻遏,称为分解代谢物阻遏, 而环腺苷酶(cAMP)可使分解代谢物阻遏作用解除。,2019/1/6,3,2019/1/6,4,2019/1/6,5,试剂和材料,1)大肠杆菌菌株。 2)营养肉汤培养基:蛋白胨5,牛肉膏3,NaCl 5,pH7。 3)0.1mol/L葡萄糖溶液。 4)0.1mol/L乳糖溶液。 5)cAMP钠盐溶液:配成0.1mol/L。 6)甲苯。 7)邻-硝基酚-D半乳糖苷(ONP
2、G)溶液:称取40 mg ONPG,溶解于100 ml,pH 7.4,0.1mol/L磷酸缓冲液中。 8)0.1mol/L,pH7.4磷酸缓冲液。 9)水浴恒温振荡器。 10)恒温水浴槽。 11)分光光度计。,2019/1/6,6,操作方法,1.将5培养过夜的大肠杆菌种子液接种于40ml营养肉汤培养基中,于37振荡培养。 2.当OD550达0.3左右时(约40min),分装到4根L-试管中,每管8.5ml培养液。 (记得标上编号),2019/1/6,7,2)4根L-试管分别添加:, 1.5ml无菌水 (建议标编号:A 1,2,3,4) 0.5 ml乳糖溶液和1 ml 无菌水; 0.5 ml乳糖
3、溶液,0.5 ml葡萄糖溶液和 0.5 ml无菌水; 乳糖溶液.葡萄糖溶液和cAMP-Na溶液各 0.5ml。,2019/1/6,8,3)将4根L-试管同时于37振荡培养,每隔20 min,分别取出2 ml培养液于小试管中,各加一滴甲苯,于37振荡30 min置冰箱以备酶活力测定。 (记得标上编号),2019/1/6,9,4.B- 半乳糖苷酶的活力测定:,取上述甲苯处理的细胞悬浮液,各取1.5mL,分别加入3 ml ONPG溶液作为底物,于30反应10 min分别测定反应前后的OD420 (若OD1.0,则需稀释),2019/1/6,10,在420 nm波长下,按上述条件测定的光密度每变化0.
4、001定义为酶的一个活力单位,即: 酶活力(单位)OD4201000,2019/1/6,11,思考题:,1.本实验的原理是什么?试分析,不同组别添加物对半乳糖苷酶合成的影响。 2.试分析实验的结果和理论结果的差异,试分析其原因。,2019/1/6,12,2019/1/6,13,2019/1/6,14,2019/1/6,15,2019/1/6,16,2019/1/6,17,2019/1/6,18,2019/1/6,19,2019/1/6,20,2019/1/6,21,2019/1/6,22,2019/1/6,23,2019/1/6,24,2019/1/6,25,2019/1/6,26,2019/
5、1/6,27,一、操纵子(operon),细菌能随环境的变化,迅速改变某些基因表达的状态,这就是很好的基因表达调控的实验模型。人们就是从研究这种现象开始,打开认识基因表达调控分子机理的窗口的。,2019/1/6,28,1.操纵子的提出,大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖,当培养基中含有葡萄糖和乳糖时,细菌优先利用葡萄糖,当葡萄糖耗尽,细菌停止生长,经过短时间的适应,就能利用乳糖,细菌继续呈指数式繁殖增长。,2019/1/6,29,大肠杆菌利用乳糖至少需要两个酶:促使乳糖进入细菌的半乳糖透过酶(lactose permease)和催化乳糖分解第一步的 半乳糖苷酶(
6、 -galactosidase)。,2019/1/6,30,在环境中没有乳糖或其他 -半乳糖苷时,大肠杆菌合成 -半乳糖苷酶量极少,加入乳糖2-3分钟后,细菌大量合成 -半乳糖苷酶,其量可提高千倍以上,在以乳糖作为唯一碳源时,菌体内的 -半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的3%。 在上述二阶段生长细菌利用乳糖再次繁殖前,也能测出细菌中 -半乳糖苷酶活性显著增高的过程。,2019/1/6,31,这种典型的诱导现象,是研究基因表达调控极好的模型。针对大肠杆菌利用乳糖的适应现象,法国的Jocob和Monod等人做了一系列遗传学和生化学研究实验,于1961年提出乳糖操纵子(lac operon)学说。,2
7、019/1/6,32,2. 操纵子的基本组成,乳糖操纵子模型已被许多研究实验所证实,对其有了更深入的认识,并且发现其他原核生物基因调控也有类似的操纵子组织,操纵子是原核基因表达调控的一种重要的组织形式,大肠杆菌的基因多数以操纵子的形式组成基因表达调控的单元。 下面就以乳糖操纵子为例子说明操纵子的最基本的组成元件(elements)。,2019/1/6,33,(1) 结构基因群,操纵子中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(structural gene, SG)。一个操纵子中含有2个以上的结构基因,多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放阅读框(open reading frame),
8、5端有起始密码ATG,3端有终止密码TAA、TGA或TAG。各结构基因头尾衔接、串连排列,组成结构基因群。,2019/1/6,34,至少在第一个结构基因5侧具有核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS),因而当这段含多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA,就能被核糖体所识别结合、并起始翻译。核糖体沿mRNA移动,在合成完第一个编码的多肽后,核糖体可以不脱离mRNA而继续翻译合成下一个基因编码的多肽,直至合成完这条多顺反子mRNA所编码的全部多肽。,2019/1/6,35,乳糖操纵子含有、和3个结构基因。 基因长3510bp,编码含1170个氨基酸、分子量为13
9、5,000的多肽,以四聚体形式组成有活性的-半乳糖苷酶,催化乳糖转变为别乳糖(allolactose),再分解为半乳糖和葡萄糖;,2019/1/6,36,基因长780bp,编码有260个氨基酸、分子量为30,000的半乳糖透过酶,促使环境中的乳糖进入细菌; 基因长825bp,编码275氨基酸、分子量为32,000的转乙酰基酶,以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。,2019/1/6,37,基因5侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点(RBS)特征的Shine-Dalgarno(SD)序列,因而当乳糖操纵子开放时,核糖体能结合在转录产生的mRNA上。 由于、三个基因头尾相接,上一个基因的翻译终止密码靠近
10、下一个基因的,2019/1/6,38,翻译起始密码,因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子(polycistron)mRNA移动,在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后,不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质,一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。,2019/1/6,39,2019/1/6,40,(2) 启动子,启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。操纵子至少有一个启动子,一般在第一个结构基因5侧上游,控制整个结构基因群的转录。 用RNA聚合酶与分离的一段DNA双链混合,再加入外切核酸酶去水解DNA,结果只有
11、被RNA聚合酶识别结合而被保护的那段DNA不被水解,由此可以测出启动子的范围及其序列。,2019/1/6,41,虽然不同的启动子序列有所不同,但比较已经研究过的上百种原核生物的启动子的序列,发现有一些共同的规律,它们一般长40-60bp,含A-T bp较多,某些段落很相似的,有保守性,称为共有性序列(consensus sequences)。 启动子一般可分为识别(R,recognition)、结合(B,binding)和起始(I,initiation)三个区段。,2019/1/6,42,转录起始第一个碱基(通常标记位置为+1)最常见的是A;在-10bp附近有TATAAT一组共有序列,因为这段
12、共有序列是Pribnow首先发现的,称为Pribnow盒(Pribnow box);在-35bp处又有TTGACA一组共有序列。,2019/1/6,43,2019/1/6,44,不同的启动子序列不同,与RNA聚合酶的亲和力不同、启动转录的频率高低不同,即不同的启动子起动基因转录的强弱不同,例如:PL、PR、PT7属强启动子,而Plac则是较弱的启动子。,2019/1/6,45,(3) 操纵区,操纵区(operator)是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列,常与启动子邻近或与启动子序列重叠,当调控蛋白结合在操纵子序列上,会影响其下游基因转录的强弱。,2019/1/6,46,以前将操纵区称为
13、操纵基因(operator gene)。但现在基因定义是为蛋白质或RNA编码的核酸序列,而操纵序列并不是编码蛋白质的基因,却是起着调控基因表达强弱的作用,正如启动序列不叫启动基因而称为启动子一样,操纵序列就可称为操纵区。operon译为操纵子,即基因表达操纵的单元之意。,2019/1/6,47,以乳糖操纵子中的操纵区为例,其操纵区(o)序列位于启动子(p)与被调控的基因之间,部分序列与启动子序列重叠。 仔细分析操纵区序列,可见这段双链DNA具有回文(palindrome)样的对称性一级结构,能形成十字形的茎环(stem loop)构造。不少操纵区都具有类似的对称性序列,可能与特定蛋白质的结合相
14、关。,2019/1/6,48,阻遏蛋白与操纵区结合,就妨碍了RNA聚合酶与启动子的结合及其后 -半乳糖苷酶等基因的转录起始,从而阻遏了这群基因的表达。 最早只把与阻遏蛋白结合、起阻遏作用的序列称为操纵区,但其后发现有的操纵子中,2019/1/6,49,同一操纵序列与不同构像的蛋白质结合,可以分别起阻遏或激活基因表达的作用,阿拉伯糖操纵子中的操纵序列就是典型的例子。因而凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列,不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放,都可称为操纵区。,2019/1/6,50,(4) 调控基因,调控基因(regulatory gene)是编码能与操纵序列结合的调
15、控蛋白的基因。调控蛋白有: 阻遏蛋白(repressive protein):与操纵区结合后能减弱或阻止其调控的基因转录,其介导的调控方式为负调控(negative regulation);,2019/1/6,51,激活蛋白(activating protein):与操纵区结合后能增强或起动其调控的基因转录,所介导的调控方式为正调控(positive regulation)。,2019/1/6,52,某些特定的物质能与调控蛋白结合,使调控蛋白的空间构像发生变化,从而改变其对基因转录的影响,这些特定物质可称为效应物(effector)。有两种: 诱导剂(inducer):能引起诱导发生的分子;
16、阻遏剂或辅助阻遏剂(corepressor):能导致阻遏发生的分子。,2019/1/6,53,例如在乳糖操纵子中,调控基因lac I位于Plac邻近,有其自身的启动子和终止子,转录方向和结构基因群的转录方向一致,编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R。 在环境没有乳糖存在的情况下,R形成分子量为152,000的活性四聚体,能特异性与操纵区紧密结合,从而阻止利用乳糖的酶类基因的转录,所以R是乳糖操纵子的阻遏蛋白;,2019/1/6,54,当环境中有足够的乳糖时,乳糖与R结合,使R的空间构像变化,四聚体解聚成单体,失去与操纵区特异性紧密结合的能力,从而解除了阻遏蛋白的作用,使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。 在这过程中乳糖就是诱导剂,与R结合起到去阻遏作用(derepression),诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放。,2019/1/6,55,许多调控蛋白都是变构蛋白(allosteric p