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1、闽北职业技术学院食品与生物工程系,一、生物学特性菌体形态及培养特征,革兰氏阳性球菌,直径为0.5-1.0微米,镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群,如葡萄状,故称为葡萄球菌。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,大多数菌株产生类胡罗卜素,使细胞团呈现出深橙色到浅黄色,色素的产生取决于生长的条件,故称金黄色葡萄球菌。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,大多数菌株最适生长温度30-37,最适pH为7.0-7.5; 兼性厌氧菌,在好氧条件下生长最好; 可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。 一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5%氯化钠肉汤增菌。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,所有的毒株
2、产生血浆凝固酶,人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。 金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和溶菌酶等,大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,生物学特性 致 病 性,金黄色葡萄球菌为条件致病菌,菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶: a.溶血素:外毒素,能损伤血小板,破坏溶酶体,引起肌体局部缺血和坏死;在血平板培养出现溶血环。 b.杀白细胞素:可破坏人的白细胞和巨噬细胞; c.血浆凝固酶:当金黄色葡萄球菌侵入人体时,该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固,阻碍吞噬细胞的吞噬作用。 d.脱氧核糖
3、核酸酶(DNA酶) e.肠毒素:引起急性胃肠炎。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌,临床表现多种多样,可引起局部化脓感染,也可引起肺炎、心包炎等,甚至败血症、脓毒症等全身感染。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,葡萄球菌皮肤感染,闽北职业技术学院食品与生物工程系,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病,可引发不同程度的急性胃肠炎症状,恶心、呕吐最为突出而且普遍,腹痛、腹泻次之。 当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品,如牛奶和奶制品、肉、蛋等,在温度条件适宜时,经8-10小时即可相当数量的肠毒素。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,二
4、、检验程序与操作方法,根据中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准: 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 GB 4789.10-94 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 验,闽北职业技术学院食品与生物工程系,检样 25g(ml)+225ml灭菌生理盐水,国标:金黄色葡萄球菌检验程序,直接计数方法,增菌培养方法,Baird-parker(贝尔德- 帕克) 0.3ml、0.3ml、0.4ml,75氯化钠肉汤或 胰酪胨大豆肉汤,血平板,血平板 ,Baird-parker,涂片染色,观察溶血,血浆凝固酶试验,报 告,36 1 24hr,36 1 24hr,36 1 24hr,闽北职业技术学院食品与生
5、物工程系,检验程序 增菌培养,利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性(可耐受15%的氯化钠),用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤或7.5%氯化钠肉汤增菌。 置37摄氏度培养箱培养24小时。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,检验程序 分离培养,血平板:金黄色葡萄球菌可以产生溶血素,因此在血平板上产生明显的溶血环。 典型菌落:呈金黄色,有时也为白色,大而突起,圆形,不透明,表面光滑,有溶血环。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,大而突起,圆形,不透明,表面光滑,有溶血环,闽北职业技术学院食品与生物工程系,血平板制作,成分:豆粉琼脂(或营养琼脂)100mL,脱纤维羊血(或兔血)5-10mL。 制法:加热融化琼
6、脂,冷至50,以无菌操作加入脱纤维羊血或兔血,摇匀,倾注平板。或分装灭菌试管,摆成斜面。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,BP(贝尔德- 帕克)平板: 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和矿物元素 丙酮酸钠是一种生长促进剂 亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性,并使菌落产生黑色 卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环 甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。,检验程序分离培养,闽北职业技术学院食品与生物工程系,在BP平板上典型菌落为:灰色到黑玉色,圆形,光滑突起,湿润,直径2-3mm,边缘常为淡色(米黄色或灰色),周围为一混浊带,在其外缘常有一透明
7、圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。 长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落,其黑色常较典型菌落淡些,且外观可能粗燥,质地较干燥。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,B-P平板,闽北职业技术学院食品与生物工程系,革兰氏阳性,球形,组成葡萄状,检验程序 鉴定之革兰氏染色镜检,闽北职业技术学院食品与生物工程系,检验程序 鉴定之凝固酶试验,金黄色葡萄球菌可以产生血浆凝固酶,因此对其鉴别的主要试验是测定其凝固酶。 方法一:试管法 吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL,放入小试管中,再加入培养24h的金黄色葡萄球肉浸液肉汤培养物0.5mL,振荡摇匀,放361恒温箱或水浴内,每半小时观察一次,观察6h,如
8、呈现凝固,即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块者,被认为阳性结果。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,试管法,闽北职业技术学院食品与生物工程系,阳性反应,阴性反应,不凝固,少量、零散凝固,明显的块状凝固,巨大块凝固,完全凝固,倒置不流动,闽北职业技术学院食品与生物工程系,有凝块,血浆,均匀混浊,生理盐水,方法二:玻片法 在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水,用接种环取待检培养物与其混合(设阳性和阴性对照)制成菌悬液,若经1020s内无自凝现象发生,则加入人或兔新鲜血浆1环(不用稀释),与菌悬液混合,观察结果 。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,兔血浆制备 成分:柠檬酸钠0.106 mol/L (31.
9、3g Na3C6H5O72H2O溶于1L蒸馏水中) 制法:一份加兔血9份混合后离心2000rpm,10min吸取上清液即为兔血浆。,闽北职业技术学院食品与生物工程系,葡萄糖肉浸液肉汤的制备,成分:绞碎牛肉500g,氯化钠5g,蛋白胨10g,磷酸氢二钾2g,葡萄糖10g,蒸馏水1000mL,pH7.47.6。 制法:将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g,与蒸馏水混合后放冰箱24h,除去液面之浮油,隔水煮沸半小时,使肉渣完全凝结成块,用绒布过滤,并挤压收集全部滤液,加水补足原量。加入蛋白胨、葡萄糖,氯化钠和磷酸盐,溶解后校正pH,煮沸并过滤、分装,12130min高压灭菌。,闽北职业技术学院食品与生物
10、工程系,25g样品+ 225ml 生理盐水,5mL样品匀液(1:10)+ 50mL胰酪胨大豆肉汤,血平板,36 1 24hr,镜 检 与 肉浸液肉汤培养,血浆凝固酶 试验,报告结果,定性 检测,36 1 24hr,36 1 24hr,36 1 6hr,BP平板,闽北职业技术学院食品与生物工程系,25g样品+ 225ml 生理盐水,选三个连续梯度,每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的BP平板(如0.4mL,0.3mL,0.3mL),平板计数(分别记录每种类型的菌落数),36 1 48hr,血平板、镜 检与 肉浸液肉汤培养,血浆凝固酶试验,报告结果 金葡菌数/g(mL),定量 检测 (平板法),
11、每种类型选取一个菌落,36 1 24hr,36 1 6hr,适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10/g(mL)的食品 计算办法:(三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加)血浆凝固酶阳性数5 稀释倍数,梯度稀释,闽北职业技术学院食品与生物工程系,第一天 器材准备、样品处理、增菌培养和BP平板分离接种,闽北职业技术学院食品与生物工程系,第二天 接种选择性平板进行分离培养和玻片法血浆凝固酶试验,1、血平板制备及兔血浆制备 2、接种选择性平板 取增菌液1环,划线接种于血平板或BP平板。 3、培养 放于361培养24h。 4、玻片法血浆凝固酶试验,第三天 观察分离结果、镜检和葡萄糖肉浸液肉汤制备及接种,第四天 血浆凝固酶试验(试管法)、实验报告,