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1、生化实验技术专题,主要内容：介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和原则；介绍层析技术、电泳技术、离心技术、超过滤技术的原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。,目录,第一节 生物大分子物质的制备 第二节 几类主要的生化实验技术 第三节 蛋白质、核酸的检测,例题,第一节 生物大分子物质的制备,一一般过程和原则,二注意事项,三纯化方案的设计和评价 例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化,确立有效成分的测定方法 材料的选择和预处理 细胞的破碎和细胞组分分离 有效成分的抽提 有效成分的纯化和浓缩,生物大分子分离纯化的一般步骤和原则,层析法 电泳法 超离心法 透析和超滤,盐析（硫酸铵盐析）
2、等点电沉淀 有机溶剂沉淀 离心,前处理 粗分级 细分级 ,材料选择与处理 细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理）,生物组织 提取液 粗产品,结晶,分子大小 溶解度 电荷性质 吸附性质 生物亲和力,依据原理,调整硫酸铵溶液饱和度计算表,注意事项,1控制适当的pH 2控制低温 3注意提取过程中的溶液环境 4防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基,宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化,纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白） （%）,1、粗酶液 80 4320 54 1 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83 3、醋酸钙沉淀 2
3、1 2980 141 2.64 69 4、盐析 4 1771 464 8.52 41 5、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 27 6、结晶 0.12 130 1072 19.70 3,第二节 几类重要的生化实验技术,一、层析技术 二 、电泳技术 三 、离心技术 四 、透析和超过滤,一层析技术（chromatography）,1层析技术一般原理 2层析技术分类 3常用层析技术及应用,层析技术原理,层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析,都是由互不相溶的两个相组成:一是固定相(固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形
4、状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。 混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的分配情况，一般用分配系数(distribution coefficient,Kd）来描述。混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。 物质在层析系统中的行为并不直接决定于其Kd，而取决于它的有效分配系数Keff :,层析法分类（按装置分类 ）,纸层析 薄膜层析 柱层析,氨基酸分析仪图解,气液色谱图解 （gas-liquid chromatigraphy）,层析柱,恒温装置,载气（流动相）,样品
5、）,进样室,检测器,记录仪,出口,高效液相层析（HPLC）图解 （high performance liquid chromatigraphy）,各类层析的原理和载体,类别 分离原理 基质或载体 吸附层析 化学、物理吸附 硅胶、氧化铝 、羟基磷酸 分配层析 两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土 、硅胶 凝胶层析 分子筛效应的排阻效应 sepharose 、sephadex 离子交换层析 离子基团的交换反应 离子交换树脂 、纤维素、 葡聚糖 亲和层析 分离物与配体之间有 带配基的sepharose 特殊亲和力 或sephadex 聚焦层析 等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团
6、的配体相偶联的 sepharose 6B）,几种主要沉淀方法比较,常用层析技术及应用,吸附层析 分配层析 凝胶过滤（分子筛层析） 离子交换层析 亲和层析,吸附层析 （absorption chromatography）,原理：,载体 ： 硅胶 氧化铝 羟基磷石灰,应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸 等生化物质,以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。,分 配 层 析 （distribup
7、tion chromatography）,原理：,载体 ：纤维素 硅藻土 硅胶,应用：各种生化物质的分离鉴定,分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自的分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。,逆流分溶原理示意图,物质Y(Kd=1)的分配情况,溶剂 A,物质Z(Kd=3)的分配情况,溶剂 B,总量,总量,总量,总量,总量,总量,平衡后,转移 1,转移 2,转移 3,分溶管号,转移 4,上相转移,下相转移,上相转移,分子
8、筛层析（gel-filtration chromatography）,基质 葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（sepharose）,应用 测定分子量 脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子 除去热原物质,原理：凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出
9、层析柱。,分子筛层析原理示意图,分子筛层析与洗脱曲线,凝胶颗粒,收集蛋白质管,蛋白质混合物,大分子,从柱上面加缓冲溶液,小分子,洗脱体积（Ve）,凝胶柱,大分子,小分子,Ve1,Ve2,V0,蛋白质Mr=49,000,洗出液中的蛋白质浓度,洗脱体积（mL）,未知,logMr,洗脱体积与相对分子质量的关系,Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo),离子交换层析 （ion-change chromatography）,原理 基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂 应用 制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分,1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合,2.吸附阶段：样品与
10、反离子进行交换,3、4. 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质,5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用,原始缓冲溶液的反离子,样品溶液,梯度浓度,离子交换层析原理示意图,NaCl梯度,梯度混合器,阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H （强酸型），羧基-COOH（弱酸型）,阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH-,常用的阳离子交换剂,离子交换剂 可电离基团 可电离基团结构,CM-纤维素（弱酸型） 羧甲基,P-纤维素（中强弱酸型） 磷酸基,SE-纤维素（强弱酸型） 磺乙基,SP-纤维素（强弱酸型） 磺丙基,常用的
11、阴离子交换剂,AE-纤维素（弱减型） 氨基乙基,离子交换剂 可电离基团 可电离基团结构,PAB-纤维素（弱减型） 对氨基苯甲酸,DEAE-纤维素 二乙基氨基乙基,DEAE -Sephadex 二乙基氨基乙基,DEAE -纤维素（强减型） 二乙基氨基乙基,QAE-纤维素（强减型）,二乙基（2-羟丙 基） -氨基乙基,（中弱减型）,（中弱减型）,亲和层析（affiuity chromatography）,应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能,a. 理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性,原理：,基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex,亲和层
12、析原理示意图,蛋白质混合物,配体,与配体结合的蛋白质,加入的可溶性配基,专一性结合蛋白质,没有结合的蛋白质,基质,几种主要层析方法比较,二 、 电泳技术,1电泳的一般原理 2. 电泳技术的类别 3、常用电泳技术 4、电泳技术的拓展,电泳的一般原理,电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象 。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。,电泳技术分类,垂直板电泳,水平
13、板电泳,圆盘电泳,常用电泳技术,1、醋酸纤维薄膜电泳 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 3、琼脂糖电泳 4、毛细管电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）,1、一般PAGE 2、SDS-PAGE 3、PAGE等电点聚焦,聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamidegel electrophoresis，PAGE）,PAGE是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶(PAG)作为支持物，采用电泳基质的不连续体系(即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性) 或 连续体系（一层凝胶、
14、一种pH和一种缓冲溶液），进行电泳分离一种方法。 PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。 化学聚合:催化剂过硫酸铵(AP)，加速剂TEMED 光聚合:催化剂核黄素，加速剂TEMED 不连续PAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应,不连续PAGE的浓缩效应,样品,浓缩胶,分离胶,快离子,慢离子,蛋白质,A,B,C,+,+,-,-,SDS-PAGE,原理： 当SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS -蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示： Log Mr=a bmr 应用: 测定蛋白质分子量 测定蛋白质亚基数,Mr（相对迁
