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1、实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的1. 掌握PCR扩增技术的基本原理2. 掌握PCR的常规操作3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用4. 了解PCR技术的应用5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素二、实验原理1. PCR基本原理聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下
2、DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配
3、对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环“变性退火延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。2. PCR反应体系标准PCR反应体系10x扩增缓冲液10 ul4种dNTP混合液200ul引物10100ul模版DNA0.12ugTaq DNA聚合酶2.5ulMg2+1.5mmol/L双蒸水100ul3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离
4、、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的DNA进行检测。电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝）作为双色电泳指示剂。其目的有：增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔
5、内；使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利；以0.5TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长700bp的双链DNA相同，二甲苯氰（蓝）则与2Kbp的DNA相同。三、实验仪器、材料和试剂1. 仪器：移液器、离心管、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统2. 材料：模版DNA 引物3. 试剂：dNTP TaqDNA聚合酶 buffer四、实验步骤1. 按照以下顺序，依次添加入PCR管内ddH2O 38.75 ul10x buffer 5uldNTP 1.25ul引物 1.25ul + 1.25 ul模版 2 ulTaq酶 0.5ul2. 将配制好的PCR体系充分混匀后，离心。3. 盖紧PCR管的盖子，插入PCR仪的孔内。4. 设定好程序，开始PCR反应。5. PCR反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。五、注意事项1. 换枪头，避免污染试剂2. 酶置于冰上，且最后加入体系中。3. PCR管的盖子一定要盖紧，以防蒸干。4. 琼脂糖凝胶电泳，方向为阴极阳极。5. 一定要戴手套保护自己。六、思考题1. PCR反应体系中主要成分有哪些？他们分别起什么作用？2. 为什么在PCR过程中要使用三个不同的温度？3. 用PCR扩增目的基因，如何提高产物的特异性？4. DNA在电泳过程中的迁移率取决于哪些因素？
