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1、“讲忠诚、严纪律、立政德”三者相互贯通、相互联系。忠诚是共产党人的底色，纪律是不能触碰的底线，政德是必须修炼的素养。永葆底色、不碰底线选修1课时14 血红蛋白的提取和分离班级:_姓名:_设计人_日期_课前预习 预习案 学习目标 1 1了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。2体验提取生物大分子的基本过程和方法。 自主梳理 1 1蛋白质的分离原理：根据蛋白质各种特性的差异分离不同种类的蛋白质，如分子的_、所带电荷的_、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。2凝胶色谱法：(1)概念：也称做_，是根据_分离蛋白质的有效方法。(2)(3)分离原理：分离物质通道路程速度相对分子质量较大凝胶外部_
2、较快相对分子质量较小_较长_3缓冲溶液：(1)组成：通常由12种_溶解于水中配制而成。(2)作用：抵制外界的酸和碱对_的影响而保持其稳定。4电泳：(1)概念：指_在电场的作用下发生_的过程。(2)原理：电泳利用了待分离样品中各种分子_以及分子本身的_的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。(3)两种常用方法：_和聚丙烯酰胺凝胶电泳。5血红蛋白的提取和分离：(3)_(即样品的加入和洗脱)：_。(4)纯度鉴定：_。6凝胶色谱操作：(1)凝胶色谱柱的制作。取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，_。选择适合封堵玻璃管口的_，中间打孔，孔径大小要能够紧密插入0. 5 m
3、L的移液管。将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴，将0. 5 mL的_头部切下5 cm长的一段，插入橡皮塞孔内，插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。将尼龙网覆盖在橡皮塞的凹穴上，再用_将橡皮塞上部包好，插到玻璃管的一端。在色谱柱下端用_头部作出口部位，连接一细的尼龙管；并用螺旋夹控制尼龙管的打开与关闭， 尼龙管的另一端放入收集器内。柱顶部的制作，在色谱柱的另一端插入安装了玻璃管的_。(2)凝胶色谱柱的装填。材料：本实验使用的是_。方法：凝胶用_充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。注意事项。a.商品凝胶使用前需直接_；b.装填时可_，使凝胶装填均匀；c.不能有气泡存在，防止其
4、_，降低分离效果；d.不能发生_的现象。检验：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。(3)样品的加入与洗脱。调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用吸管将(1)mL透析后的样品加到色谱柱的_样品渗入凝胶床：打开下端出口 ，使_洗脱：打开下端出口 ，用_洗脱收集：待_接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集 预习小测 1 1判断正误：凝胶色谱法分离蛋白质时利用了蛋白质相对分子质量大小和形状的不同。2判断正误：在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢。3判断正误：电泳时带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。4判断正误： 猪成熟红细胞中
5、缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少。5判断正误：用于透析的薄膜具有选择透过性。6判断正误：可通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。7判断正误：若红色区带不均匀地移动，说明色谱柱制作成功。知识拓展 探究案 探究1凝胶色谱法与电泳法 1 1凝胶色谱法的概念：凝胶色谱法也称作分配色谱法，是根据_的大小分离_的有效方法。2凝胶色谱法的凝胶色谱法的原理：大多数凝胶是一些微小的_球体，内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量_的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量_的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程_，移动速度_；而相对分子质量_的蛋白质无法进人凝胶内部的通道，只能在_移动，路程_，移动速度_。相对分
6、子质量不同的蛋白质因此得以分离。3缓冲溶液的作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界的酸和碱对溶液_的影响，维持pH基本不变。4缓冲溶液的配制通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。5电泳的概念：指_在_的作用下发生_的过程。6电泳的原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有_的基团，在一定的PH下，这些基团会带上_或_。在电场的作用下，这些带电子分子会向着与其所带电荷_的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子_的差异以及分子本身的_、_不同，使带电分子产生不同的_，从而实现样品中各种分子的分离。7常用的电泳方法：_和_。8凝胶色谱法(
7、见下表)白质的分离原理根据需要被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离白质分子运动情况类型相对分子质量大相对分子质量小大小直径较大直径较小方向垂直向下运动无规则扩散速度较快较慢路径较短较长洗脱次序先流出后流出9电泳法(见下表)原理电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度， 从而实现样品中各种分子的分离常用方法琼脂糖凝胶电泳由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小和形状不同而不同，从而得以分离聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中所带
8、的电荷被掩盖，使电泳迁移率完全取决于分子的大小 典例精析 1 下列关于电泳的叙述中，正确的是A.电泳是指不带电的分子在电场的作用下发生迁移的过程B.电泳的过程要在一定的pH下，所以一定要使用缓冲液C.交联葡聚糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常用的电泳方法D.聚丙烯酰胺凝胶电泳中，溶液中加人十二烷基硫酸钠(SDS)，电泳的迁移率主要取决于分子所带电荷的多少和相对分子质量的大小 变式训练 1 凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须A.具有相同的相对分子质量B.相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子C.相对分子质量不
9、同，但都是相对分子质量较小的分子D.具有不同的相对分子质量 探究2血红蛋白的提取和分离实验操作 1 10蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。(1)样品处理红细胞的洗涤：采集血样，低速短时间_，吸出_后加生理盐水洗涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。目的是除去杂质， 以利于后续步骤的分离纯化。血红蛋白的释放:将洗涤好的红细胞依次加入_至原血液体积、40%体积的_，置于磁力搅拌器上搅拌10 min，使红细胞吸水_，血红蛋白释放出来。分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液转移到_中，以2 000 r/min的速度_ 10 min。使血红蛋白和其他杂
10、质分离开，便于下一步对血红蛋白的纯化。透析：取1 mL的血红蛋白溶液装人透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h(以除去样品中相对分子质量较小的杂质)。(2)凝胶色谱操作凝胶色谱柱的制作：准备材料加工_安装_。凝胶色谱柱的装填。样品的加入和洗脱。11蛋白质的提取和分离：样品处理(1)红细胞的洗涤过程：a.采集血样b.低速短时间离心c.吸出血浆 d.盐水洗涤e.低速离心f.重复d、e三次。目的：除去杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。注意事项：离心时转速要低，离心时间要短，一般为500 r/min，离心2 min，否则白细
11、胞一同沉淀，达不到分离效果。洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数， 否则血浆蛋白无法除净。(2)血红蛋白的释放过程(见下图)：目的：使红细胞涨破，血红蛋白释放出来。结果：在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液过程:将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min 的速度离心10 min。目的:经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。结果：溶液分为4层第1层(最上层)：甲苯层(无色透明)第2层(中上层)：脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体)第3层(中下层)：血红蛋白的水溶液层(红色透明液体)第4层(最下层)：杂质沉淀层(暗红色
12、)将试管中液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层；于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。12蛋白质的粗分离透析(1)原理透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。(2)过程取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。(3)目的除去样品中相对分子质量较小的杂质。用于更换样品的缓冲液。13蛋白质的纯化凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。柱底部制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。柱顶部制作：打孔安装玻璃管。组装:将上述三部分按相应位置组装成一个整体。(2)凝胶色谱柱装填计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液固定:将色谱柱垂直固定在支架上装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内洗涤平衡:用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7. 0)洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密(3)样品的加人和洗脱调整缓冲液面：打开色谱柱下端流出口，调整缓冲液与凝胶面平齐滴加透析样品:关闭下端出口，用吸管小心将1 mL样品 加到色谱柱顶端样品渗人凝胶床:加
