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1、细胞工程,番茄与马铃薯同是茄科植物，但不是同属的植物。番茄的果实和马铃薯的块茎是我们经常食用的蔬菜。马铃薯的块茎生长在土壤中。 人们曾经有这样一个幻想：让一株植株地上部分结番茄，地下部分长土豆。这个幻想可能实现吗？,一、细胞工程的概念,细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。,细胞工程,应用的原理和方法,细胞生物学和分子生物学,细胞水平或细胞器水平,按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品,概念,分类,植物细胞工程,研究的目的,研究的水平,动物细胞工程,前者是细胞水平或
2、细胞器水平上生物技术, 后者是分子水平上的生物技术。,克隆多莉羊技术是 水平上的技术 培育抗虫棉是 水平上的技术。,细胞工程与基因工程相比：,细胞,分子,思考:,为什么植物的一个花瓣能培养出完整的植株呢？,细胞具有全能性,1、定义：,具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。,2、原理：,生物体的任何一个细胞都包含有该物种 所特有的全套遗传物质，都有发育成为 完整个体所必需的全部基因，从理论上 讲，生物体的每一个活细胞都应该具有 全能性。,3、大小：,二、细胞的全能性,二、细胞的全能性,当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激
3、素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。,在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。,为什么生物体内的细胞没表现全能性，而是分化成不同的组织或器官呢？,基因选择性表达的结果,植物细胞表现全能性的必要条件：,离体培养 提供营养物质、激素及其他适宜条件 那么要如何把植物的一个花瓣培育成完整的植株呢？,植物的组织培养,1、实验原理：,离体的植物器官、组织或细胞,一定的营养物质、激素,脱分化,愈伤组织,再分化,含有不同激素的分化培养基,胚状体或丛芽,试管苗,外植体：从活植物体上切下进行
4、培养的那部分组织或器官,三、植物的组织培养,愈伤组织：离体的植物 器官、组织或细胞，在培 养一段时间以后，通过细 胞分裂，形成由一种高度 液泡化、无定形状态的薄 壁细胞所组成的排列疏松 无规则且具有分生能力的 组织。,（1）愈伤组织,植物细胞的再分化：脱分化产生的 愈伤组织在培养过程中重新分化根 或芽等器官的过程。,（2）脱分化和再分化,植物细胞的脱分化：由高度分化的植物器官组 织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。,脱分化的实质和结果分别是什么？,实质是恢复细胞的全能性过程。 结果是形成愈伤组织。,(3)生长素和细胞分裂素作用,植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性
5、激素。,有利于根的分化,有利于芽的分化，抑制根的分化,促进愈伤组织生长,生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响,（4)植物组织培养过程,离体组织、器官或细胞,植物体,细胞分裂素生长素,愈伤组织,芽,根,细胞分裂素生长素,细胞分裂素生长素,不需要光,需要光,为什么诱导愈伤组织的过程中应避光培养？ 因为植物组织培养脱分化主要是培养出愈伤组织，一旦被光照以后会促进组织分化，无法达到实验目的。,植物组织培养的培养基,定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长的基质 无机营养成分：C、H、O大量元素及部分微量元素 有机营养成分 ： 含N物质：包括维生素和氨基酸 碳源：2%5%的蔗
6、糖 琼脂：用于凝固形成固体培养基 激素：生长素和细胞分裂素 PH值：5.06.0,2、实验流程 P34实验,制备外植体,接种,脱分化培养,再分化培养,试管苗,正常植株,实验关键： （1）全程无菌操作（包括接种用具、接种环境、接种材料、接种过程、培养过程）。 （2）取材：应选择含形成层的部分，易诱导形成愈伤组织。 （3）植物激素的比例适当。,在组织培养实验中，为什么要强调所用器械的灭菌和实验人员的无菌操作？,防止杂菌污染，因为杂菌生长快，会和培养物争夺营养。杂菌生长过程中会产生有害的物质，导致培养物迅速死亡。,在本实验中，为什么切取胡萝卜块根时强调要切取含有形成层部分，原因是这部分容易诱导形成愈
7、伤组织。请思考一下，胡萝卜的其他部分（如茎、叶、花），是否也能培养成小植株？,切取胡萝卜含有形成层部分，是因为这部分容易诱导形成愈伤组织。胡萝卜的其他部分（如茎、叶、花）也能培养再生形成小植株，只是诱导愈伤组织比较困难。,试管苗大规模培养,植物组织培养的概念：,植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。,因为不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的。,于是，科学家试图用这两种植物的体细胞进行杂交，来实现这一美妙的设想。,这幅番茄马铃薯图利用传
8、统有性杂交方法能实现吗？为什么？,理想图,1972年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。,背景资料,1978年梅尔彻斯(Melchers)等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种 “马铃薯番茄”。,植物体细胞杂交技术,1、概念,将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。,四、植物体细胞杂交技术,杂种植株,融合的原生质体AB,再生出细胞壁,脱分化,愈伤组织,再分化,2、过程,植物细胞的融合,植物组织培养,植物细胞A,原生质体B,原生质体A,杂种细胞AB,去 壁,去 壁,人 工 诱 导,融合完成的标志,植物细胞B,四、植物
9、体细胞杂交技术,融合体,杂种细胞,去壁的常用方法：,酶解法（纤维素酶、果胶酶等）,原生质体融合 方法：,物理法：离心、振动、电刺激等,化学法：聚乙二醇（PEG）,过程：原生质体融合 + 组织培养,融合的细胞中，两两融合的细胞有几种？对融合的细胞如何处理得到所需杂交细胞。,3种（AA,AB,BB）；需进行筛选。,4、意义（与传统有性杂交相比）： 克服了不同种生物远缘杂交不亲和的障碍；打破了物种之间的生殖隔离；扩大了遗传重组范围。,3、原理： 细胞膜的流动性；植物细胞全能性,思考与探究,1、为什么“番茄马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？ 主要原因是：生物基因的
10、表达不是孤立的，它 们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃 薯番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种 的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互 干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物 质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、 地下结马铃薯就是很自然的了。,白菜,“白菜甘蓝”同普通白菜相比，具有生长期短、耐热性强和易于贮藏等优点。,紫甘蓝,思考：白菜、甘蓝是二倍体，那么获得的白菜甘蓝是几倍体？,四倍体,白菜甘蓝,若A含有2N条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb，B含有2M条染色体，2个染色体组，基因型为ccDd，则新植株应为四倍体，其体细胞中染色体数为2N+2M,基因型为AabbccDd。,
11、所采用技术的理论基础,植物细胞工程,通常采用的技术手段,植物组织培养,植物体细胞杂交,植物细胞的全能性,小结,比较,无性繁殖,细胞全能性,脱分化 再分化,保持优良性状；繁殖 速度快、大规模生产； 提高经济效益,杂交技术应用了组织培养,克服不同种生物远源杂交的障碍,去除细胞壁 融合形成杂种细胞 组织培养,细胞膜流动性 细胞全能性,染色体变异、基因重组,动物细胞工程,专题2 细胞工程,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体制备,动物体细胞核移植技术和克隆动物,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核移植,动物细胞工程常用技术,其它动物细胞工程的基础,一、动物细胞培养的应用和概念：,1、概念：
12、动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,2、原理：细胞增殖,定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。,胰蛋白酶处理,取出组织,胚胎或幼龄动物器官组织,剪碎,单个细胞,细胞悬液,转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长长成单层细胞。有接触抑制现象）。,原代培养,3：过程,图示,原代培养,强调一：细胞贴壁过程,细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。,培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、 易于贴附。,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,强
13、调二：接触抑制,定义： 当原代培养的细胞处于接触抑制后, 用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）,传代培养,细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。,细胞系、细胞株（了解即可）,细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。,3、总结：动物细胞培养过程,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,配置细胞悬液,剪碎用胰蛋白酶处理,10代细胞,转入培养瓶,40-50代细胞,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液稀
14、释,传代10代以内，遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。,传代10-50代左右，增长缓慢以至于完全停止，部分细胞核型可能发生变化（遗传物质可能改变）,为什么用胰蛋白酶处理？,分瓶传代培养,原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制,继续传代培养少部分细胞获得不死性，细胞突变，遗传物质已经改变，等同于癌细胞。,细胞株：一般说遗传物质未改变,细胞系：遗传物质已改变,原代培养,4.动物细胞培养的条件:,1）无菌无毒 的环境：,适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.50.5。 适宜的酸碱度：PH：7.2-7.4,液体合成培养基：（糖、氨基酸）、促生长因子、（水、无机盐、微量元素）等；通常还需加入血浆、血清
15、等天然成分。,4）气体环境：,2）营养：,3）温度和pH：,“95空气+5CO2”的混合气体培养箱。氧气是细胞代谢必须的； CO2维持培养液的PH。,对培养液和所有培养用具无菌处理；培养液中添加抗生素防止培养过程中污染；定期更换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。,问题3：为什么用胰蛋白酶处理？,问题1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。,问题2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰 蛋白酶处理动物组织，可
16、以使动物组织细胞间的蛋白质和 细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。,问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？,动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。,问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？,控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。,问题6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,问题7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,问题8、动物细胞培养的原理：,细胞增殖。,问题9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内
