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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病的检测与临床意义的研究 作者:任海全，唐天华，毕可红，张玉昆，赵良玉，郭桂月，刘秀兰，姜枫勤，刘传芳，彭军，田志刚 摘要 目的 检测完全缓解后急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病(MRD)，同时 分析 其对预后判断的指导价值。 方法 建立逆转录PCR(RT/PCR)用以检测APL患者PML/RAR。 结果 RT-PCR方法敏感而可重复。 治疗 前APL患者的RT-PCR阳性率为%(39/42)，而维甲酸或化疗诱导完全缓解后MRD阳
2、性率为%(21/37)。另外，MRD阳性与缓解后APL患者的复发有关，并可以作为缓解后预测APL患者复发的指标。同时有助于指导临床上采取巩固治疗而防止复发。 结论 RT-PCR能够检测APL患者的MRD和作为预测复发的指标。 关键词 急性早幼粒细胞白血病；微小残留病；RT/PCR 白血病患者完全缓解后的微小残留病已被证实与复发有关1。MRD的检测也成为指导缓解后进一步化疗的重要指标2。在 目前 血液病的 应用 实践中，MRD检测的最好例子是骨髓移植后RT-PCR法检测慢性粒细胞白血病的BCR-ABL融合基因3。 急性早幼粒细胞性白血病以特异的染色体t易位为特征4。最近，许多实验室发现t易位后，
3、通过15染色体上的PML基因和17染色体上的RAR基因并列而导致融合基因PML/RAR形成5。根据PML断裂点的位置不同，可以产生2个主要的PML/RAR异构体。断裂点位于PML内含子3或4，则PML外显子3和RAR外显子3之间形成短型融合mRNA产物，而断裂点位于PML内含子6或下游，PML内含子6和RAR外显子形成长型融合体6，7。RT-PCR法的建立正是依赖于断裂点的位置而设计适当寡核苷酸引物，继而扩增PML/RARmRNA异构体8。另外，RT-PCR的高度敏感性使得MRD的检测成为可能，并可在APL患者临床缓解期时早期预测白血病的复发。 1 资料与方法 病例选择 本 研究 中的42例患
4、者均为1993XX年发病，男26例，女16例，年龄1272岁，根据FAB标准9诊断为APL。全部病例均经全反式维甲酸治疗3060mg/诱导缓解。巩固化疗方案为标准的HOAP或DA方案。巩固治疗后处于缓解期的患者采用全国维甲酸协作治疗组建议的ATRA与化疗联合治疗方案维持治疗10。骨髓单个核细胞用Ficoll分离并保存于液氮中。 1. RNA提取 10ml淋巴细胞分离液加于试管中，然后2ml骨髓细胞缓慢加入试管中，离心4000r/min0min。取单个核细胞移入另一试管中，再用异硫氢酸胍-酚-氯仿一步法抽提RNAs11。提取时注意避免样品间的交叉污染。 1. 筑巢式RT-PCR检测 APL的PM
5、L/RAR检测方法：8个寡核苷酸引物用于逆转录、扩增，检测其长或短型异构体。 逆转录引物：A-TGGATGCTGCGGCGGAAGAAGCCCTTGCAG-3 PML/RAR引物：B-GTCATAGGAAGTGAGGTCTTC-3C5-CCGATGGCTTCGACGAGTTC-3 D5-CTCACAGGCGCTGACCCCAT-3E5-AACAGCAACCACGTGGCCAG-3F5-TTCAAGGTGCGCCTGCAGGA-3 G5-AGCCTGAGGACTTGTCCTGA-3H5-GCTGCTCTGGGTCTCAAT-3正常RAR转录引物：I5-GCCTCCCTACGCCTTCTTCTTC
6、T-J5-AAAGCAAGGCTTGTAGATGC-3 K5-GACCACTCTCCAGCACCA-3L5-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAACT-3 RT-PCR方法与步骤按照早期报道的方法进行12。 1. PCR产物分析 取10l第2轮PCR产物在%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭1g/ml染色，照相。并移至尼龙膜上，用5末端寡核苷酸探针杂交，放射自显影30min，拍片。 1. 统计学方法 采用t检验。 结果 .1 PCR产物的结果及其敏感度 PML/RAR的L、S异构型。RT-PCR的敏感度为10-6。 图1 PML/RAR类型 . RT-PCR阳性百分率 用全反式维甲酸治疗前APL患
7、者PML/RAR的检测，34例为L型阳性，5例为S型阳性。L型、S型或2型的总阳性百分率分别为%、%和%。APL患者CR后的MRD阳性率是%。见表1。 表1 APL患者RTPCR检测阳性率的变化 注：*cases with APL not getting CR . APL患者MRD的变化 缓解不同时期的APL患者MRD的变化。结果显示：CR后MRD百分率降低，57年MRD百分率比缓解后低。另外，长期CR的7例中有5例生存超过7年，并且持续MRD阴性。 图2 CR时间与MRD变化关系 . 复发与MRD之间的关系 见表2。结果显示，在2年和3年内，MRD阴性的APL患者复发百分率低于MRD阳性AP
8、L患者的复发百分率。缓解2年和3年内，MRD阴性患者第一次复发的平均时间低于MRD阳性患者。 表2 MRD阳性和MRD阴性患者复发百分率和复发时间变化 P-S:survival percent of the MRD positive P-F: disease-free survival percent of the MRD positiveN-S:survival percent of the MRD negativeN-F:disease-free survival percent of the MRD negative 图3 MRD阳性和MRD阴性患者无病生存率和存活百分率比较 . MRD
9、检测对 治疗 的指导意义 APL患者CR后MRD检测的意义在于指导此病的治疗，尤其是当MRD阴性转为MRD阳性时。CR后7例MRD阴性转为MRD阳性时给予巩固化疗。7例中有4例再一次转阴。他们均无病状态存活超过5年。另有3例存活3年无复发。相反，4例转为阳性无巩固治疗的MRD检测316个月复发。其中2例没有获得第2次缓解而死亡。 . 无病生存率与存活百分率 MRD阳性和MRD阴性患者持续无病存活百分率和总的存活率。结果显示，第一次CR后1或2年时2组之间的无病生存率或总的存活率差异无显著性。随访3或5年，MRD阴性患者的无病生存率均明显高于MRD阳性患者。3年时的2组存活率差异无显著性，而5年
10、时两组的存活率差异有显著性。 讨论 已经证实ATRA可以有效地诱导APL患者取得完全缓解10，13。根据本 研究 结果和其他报道材料，患者伴有t或PML/RARRT-PCR阳性的APL患者约95%以上对于足够疗程的ATRA有效。然而，单独 应用 ATRA作为缓解后的治疗，大多数患者在6个月内复发14。说明尽管ATRA在临床上可以有效地诱导APL患者完全缓解，但在大多数患者中它不能充分消除白血病细胞克隆。因为APL患者复发的原因之一是由于MRD的存在，因此CR后应该采用化疗与ATRA治疗相结合，以消除MRD和预防复发。 尽管化疗或ATRA能诱导APL患者的临床缓解，但少量的恶性细胞仍在体内存留或
11、成为MRD状态。MRD是白血病复发的最重要的原因。但它很难通过外周血的常规形态学检测到，而只能通过特异和敏感的PCR或RT-PCR 方法 检测到。在 目前 的研究中，RT-PCR检测APL中的MRD是有应用价值的。因为其敏感度是10-6，它足以检测MRD。此与其他报道结果相似15。用建立的RT-PCR方法进行PML/RAR融合基因检测，即用于检测APL缓解后的MRD。结果显示，初诊时L型异构体、S型异构体或总异构体阳性百分率分别是%，%和%。而APL患者CR后MRD阳性率为%。MRD百分率低于其他报道15。可能与敏感度大小或选择的不同病例有关。 年和3年内，APL患者MRD阴性的复发率低于MR
12、D阳性者，而MRD阳性患者缓解后第一次复发的平均时间低于其阴性者。因此，提示MRD阳性患者易复发16，MRD检测可作为预测复发的指标。另外，MRD百分率随着CR后的时间延长而减低。如5年和7年MRD百分率明显低于初次CR后的相应MRD百分率。以往未见类似现象的报道。另一方面，7例长期CR超过7年的患者中，有5例持续MRD阴性。 APL缓解后检测MRD的意义在于指导此病的治疗。尤其当MRD阴性转为阳性时。本研究中7例缓解后患者从MRD阴性转为阳性，在给予巩固治疗后，有4例再一次转阴，并在无病状态下存活超过5年。另有3例也存活3年无复发。相反，有4例MRD转为阳性者没有给予巩固治疗，在MRD检出后
13、的316个月内复发，其中2例没有得到第2次缓解而死亡。根据目前研究结果，MRD阳性，尤其是由阴性转为阳性者，可以指导临床工作者采取进一步治疗措施，以尽可能早的消除MRD，并获得长期缓解。 另外，在第一次CR后的12年内，MRD阴性和阳性2组之间的存活百分率或无病生存率差异无显著性。但在3和5年时，2组间的无病生存率差异有显著性，MRD阳性者低于其阴性者。至于存活百分率方面，3年时2组之间无明显差别，5年时差异明显。因此，此结果进一步说明RT-PCR检测MRD能预告APL复发。与陈竺等15的报道结果一致。但是，后者比我们观察的时间短。 总之，在APL缓解期经ATRA或巩固治疗后MRD阳性者有可能
14、复发。据此我们建议APL患者CR后最好应用RT-PCR连续检测MRD，当缓解期MRD阳性时，及时给予治疗。 参考 文献 1 Baruchel A，Schaison G. Detection of minimal residual disease in leukemias. Nouv Rev Fr Hematol，1990，32:21. Hoelzer D，Thiel E，Loffer H，et al. Prognostic factors in a multicenter study for treatment of acute lymphoblastic leukemia in adults. Blood，1988，71:123. Nigrin RS，Blume KG. The use of polymerase chain reaction for the detection of minimal residual malignant ，1991，78:255. Castaigne S，Chomienne C，Daniel MT，et al. Alltrans retinoic acid as a differentiation therapy for acute promyelocytic leukemia. I Clinical results. Bl
