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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果微波辐射性雄小鼠生殖功能障碍的中医证候研究微波辐射严重地危害着人们的健康。生殖系统是微波辐射敏感的靶器官，持续地微波辐射可以导致男性不育症1。中医药对微波辐射导致的男性不育症有很好的防治作用2-4，但目前大多是应用单方对症治疗。辨证论治是中医理论与临证实践的完美结合，与单方对症治疗相比辨证论治能解决更复杂的临床问题，因此微波辐射导致的男性不育症的中医证候学研究意义重大。本课题组曾对具有微波辐射职业暴露史之男性不育症患者进行症状观察及证候分析，探讨了其中医证候特点
2、，发现随着辐射时间延长，患者最终表现为肾精亏虚证5，6，但由于男性不育症病因复杂，这些患者除微波损伤外，还可能存在其他病因，因此，微波辐射职业暴露患者表现出的证候并不单纯，其证候往往不是联盟微波辐射性男性不育症的真实证候。为此，本课题组进行动物实验，利用动物实验的可控性，研究单纯微波辐射所致的真实证候。1材料11动物选清洁级8周龄健康雄性BALB/C小鼠250只，体重2030g，由大连医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXKXX-0002。在我校实验室进行环境适应一周，适应期间照明采用12h明/暗周期。自由饮水进食，二级喂养。之后进入实验。12主要仪器微波治疗仪、微波泄露检测仪、电子天
3、平AR1140、共聚焦显微镜 Ti-E）、YTD-XX系列医学影像工作站字XX第号）、YFY电煎密闭型单体煎药机等。13药物金匮肾气丸，小鼠每日每公斤体重用药量02g；十全大补丸，小鼠每日每公斤体重用药量036g；龙胆泻肝丸，小鼠每日每公斤体重用药量024g；柴胡疏肝丸，小鼠每日每公斤体重用药量04g。上述小鼠用药量即为成人临床每日每公斤体重用药量。左归丸、少腹逐瘀汤、苍附导痰丸三方没有成药，故将其分别按原方用量水煎制成煎剂，即每个方取525g生药加水，通过YFY电煎密闭型单体煎药机煎制，设文火，持续煎1h，煎出药液XXmL。成人临床用药每日200mL，体重按50kg计算，即0004mL/g体
4、重，故小鼠用药量每日每克体重0004mL。2方法应用“以方测证”法进行小鼠的证候研究。“以方测证”法：即通过文献进行循证医学研究，总结男性不育症临床证候及代表方剂，用不同的代表方治疗微波辐射性生殖功能障碍雄小鼠，观察疗效并进行证候研究。有效方剂所代表的证候就是微波辐射损伤性雄小鼠生殖功能障碍的证候。21动物分组及施加因素雄性BALB/C小鼠250只，随机分为25组，每组10只。平行对照组：选小鼠10只。仅将小鼠置于微波治疗仪下，不开机照射，但均要抓取一次，以保证和辐射对照组及治疗组的小鼠饲养条件相同，不做任何治疗。基准造模分组研究：选小鼠80只，进行基准造模。即将小鼠分别暴露于频率为2450M
5、Hz连续微波中，功率密度为10mW/cm2，辐射18d，每天辐射1h7。将基准造模的80只小鼠分为8组，即：基对组10只，生理盐水分别灌胃。基金组10只，金匮肾气丸分别灌胃。基左组10只，左归丸分别灌胃。基十组10只，十全大补丸分别灌胃。基龙组10只，龙胆泻肝丸分别灌胃。基柴组10只，柴胡疏肝散分别灌胃。基少组10只，少腹逐瘀汤分别灌胃。基苍组10只，苍附导痰汤分别灌胃。加功造模分组研究：选小鼠80只，增加功率密度进行造模，即在基准造模其他条件不变基础上，将其功率密度增至为40mW/cm2。将加功造模的80只小鼠分为8组，即：功对组10只，生理盐水灌胃。功金组10只，金匮肾气丸分别灌胃。功左组
6、10只，左归丸分别灌胃。功十组10只，十全大补丸分别灌胃。功龙组10只，龙胆泻肝丸分别灌胃。功柴组10只，柴胡疏肝散分别灌胃。功少组10只，少腹逐瘀汤分别灌胃。功苍组10只，苍附导痰汤分别灌胃。加时造模分组研究：选小鼠80只，增加辐射时间进行造模，即在基准造模其他条件不变基础上，将其辐射时间增至每天4h。将加时造模的80只小鼠分为8组，即：时对组10只，生理盐水分别灌胃。时金组10只，金匮肾气丸分别灌胃。时左组10只，左归丸分别灌胃。时十组10只，十全大补丸分别灌胃。时龙组10只，龙胆泻肝丸分别灌胃。时柴组10只，柴胡疏肝散分别灌胃。时少组10只，少腹逐瘀汤分别灌胃。时苍组10只，苍附导痰汤分
7、别灌胃。 2小鼠精子参数测定及睾丸病理变化 取上述小鼠脱颈处死，先用电子天平测重并记录，迅速剖开附睾及附睾管，用01mL生理盐水冲洗，滴于2份载玻片上，1份用YTD-XX系列医学影像工作站精子检测仪检测精子活率，另1份伊红染色，观察畸形精子，计算畸形率。对各实验组小鼠进行精子总活率、快速向前精子率和精子畸形率测定。取上述小鼠睾丸，先用电子天平测重并记录，以便之后计算睾体比；之后迅速将睾丸置于10%福尔马林中，固定24h，石蜡包埋，HE染色，切片，光镜观察组织形态学改变。对小鼠精子PR+NP、PR、精子畸形率、睾体比及睾丸病理学改变进行比较。首先对基准造模、加时造模、加功造模及平行对照组之间的疗
8、效进行比较研究，以判断不同辐射量对小鼠生殖功能影响程度；之后，对基准造模、加时造模、加功造模各组组内及组间进行比较研究，判断有疗效的组分，以确定证候。23统计学方法所有数据均采用Stata120版统计软件进行分析，各组检测结果以表示。多样本比较，首先采用方差分析，在方差分析中，通过bartlett的卡方值来检验等方差假设，然后再用kruskal-wallis检验，进一步检验均值相等的原假设。两样本均数比较首先采用t检验，无论是双边检验，还是单边检验，显著性水平一律取5%。3结果31各组小鼠精液参数及睾体比311不同微波辐射对小鼠精液参数及睾体比的影响4组方差分析差异显著，基对组、功对组、时对组
9、均可以使小鼠精子PR+NP、PR显著低于正常，畸形率显著高于正常；对PR+NP、畸形率，时对组和功对组与基对组均未见显著差异；对PR，时对组显著低于基对组，功对组却显著高于基对组，时对组明显低于功对组。在基对组、时对组时睾体比没有显著改变，但功对组睾体比显著变小，即可以导致睾丸萎缩。见表1。312不同药物对基准微波辐射小鼠精液参数及睾体比的影响各组PR+NP、PR、畸形率的参数进行方差分析差异显著。7个药物治疗组PR+NP均值最高者是基金组，只有金匮肾气丸明显提高了精子总活率，并且使之恢复了正常。PR均值最高者是基金组，金匮肾气丸、龙胆泻肝汤皆明显提高了快速向前运动精子率，但金匮肾气丸最好，并
10、且使之恢复了正常。畸形率均值最低者是基金组，金匮肾气丸、龙胆泻肝汤、左归丸均降低精子畸形率，但没有恢复正常。各组睾体比进行方差分析，没有显著差异，表明基准微波辐射对小鼠睾丸重量没有影响，用药与否仍然无差别，kruskal-wallis检验，睾体比中位数全相等，无差异。见表2。313不同药物对加功微波辐射小鼠精液参数及睾体比的影响加功各组PR+NP、PR、畸形率的参数进行方差分析有差异。7个药物治疗组PR+NP均值最高者是功金组，金匮肾气丸、柴胡疏肝散、左归丸、十全大补汤、苍附导痰汤治疗皆有效，提高了精子总活率，但金匮肾气丸最好，治疗后使之恢复了正常；其他虽有效，但没有恢复正常。PR均值最高者是
11、功柴组，功金组位于第二，柴胡疏肝散及金匮肾气丸都能提高了快速向前运动精子率，并且使之恢复了正常，二者没区别。畸形率均值最低者是功金组，金匮肾气丸、左归丸、十全大补丸能降低精子畸形率，但没有使之恢复正常。对平行对照组、功对组及7个药物治疗组睾体比进行方差分析有差异，对功对组与7个药物治疗组睾体比进行方差分析无明显差异，但应用kruskal-wallis检验发现7个治疗组的睾体比中位数不全相等，有差异。对7个药物治疗组睾体比进行方差分析无明显差异，但是kruskal-wallis检验发现7个治疗组的睾体比中位数不全相等。7个药物治疗组睾体比均值最高者是功金组，只有金匮肾气丸治疗有效，提高了高强度微
12、波辐射小鼠的睾体比，实际上是修复了加功微波辐射引起的小鼠睾丸萎缩，治疗后并且恢复了正常。见表3。314不同药物对加时微波辐射小鼠精液参数及睾体比的影响加时各组PR+NP、PR、畸形率的参数进行方差分析有显著差异。7个药物治疗组PR+NP均值最高者是时金组，金匮肾气丸、柴胡疏肝散、左归丸、苍附导痰汤、龙胆泻肝汤、十全大补丸、少腹逐瘀汤皆能提高了精子总活率，其中金匮肾气丸疗效最好并且使之恢复了正常，其他虽有效，但未恢复正常。PR均值最高者是时金组，金匮肾气丸、柴胡疏肝散、左归丸、苍附导痰汤、龙胆泻肝丸、十全大补丸都能提高了快速向前运动精子率，其中金匮肾气丸、柴胡疏肝散疗效最好，可以使之恢复正常，但
13、左归丸、苍附导痰汤、龙胆泻肝丸、十全大补丸作用不大，不能恢复正常。畸形率均值最低者是时金组，金匮肾气丸、十全大补丸、柴胡疏肝散都能降低精子畸形率，上3种药皆不能使畸形率恢复正常。各组睾体比进行方差分析没有显著差异，kruskal-wallis检验，睾体比中位数全相等，也无差异，表明加时微波辐射对小鼠睾丸重量没有影响，用药与否仍然无差别。见表4。32病理改变平行对照组小鼠睾丸的生精小管界膜完整平坦，生精小管内可见成熟精子，各类生精细胞排列整齐，层次清楚，间质细胞结构正常。基准对照组小鼠睾丸生精小管上皮排列疏松，各类生精细胞排列不整齐，层次不清楚，部分生精小管内生精上皮变薄，甚至生精小管管腔断裂，
14、精原细胞形态基本正常，支持细胞、精母细胞、精子细胞变性、坏死脱落，生精小管管腔内可见蛋白水肿液和脱落细胞，精细数目明显减少。基金组小鼠睾丸的生精小管界膜完整平坦，生精小管内可见成熟精子，各类生精细胞排列整齐，层次清楚，间质细胞结构正常；基苍组、基柴组、基龙组、基少组、基十组、基左组未见明显改善。图1平行对照组图2基对组图3基苍组图4基柴组图5基金组图6基龙组图7基少组图8基十组图9基左组加时对照组小鼠睾丸精原细胞肿胀，偶见精原细胞溶解、消失。可见较多的精母细胞完全变性、坏死、脱落，结构正常的精母细胞也可见连接松散，失去正常的细胞序列，出现细胞排列紊乱，精细胞变性、坏死、脱落，精子极少，多数生精
15、细胞管腔内无精子细胞存在。时金组小鼠睾丸的生精小管界膜基本完整平坦，生精小管内可见成熟精子，各类生精细胞排列较为整齐，层次较为清楚，间质细胞结构基本正常；时苍组、时柴组、时龙组、时少组、时十组、时左组未见明显改善。加功对照组小鼠睾丸的精原细胞也出现肿胀，也可见溶解、消失。精母细胞完全变性、坏死、脱落，结构正常的精母细胞也可见连接松散，失去正常的细胞序列，出现细胞排列紊乱，精细胞变性、坏死、脱落，偶见精子，多数生精细胞管腔内无精子细胞存在。功金组小鼠睾丸的生精小管界膜基本完整平坦，生精小管内可见成熟精子，生精细胞排列较为整齐，层次清楚；功苍组、功柴组、功龙组、功少组、功十组、功左组未见明显改善。
16、图10时对组图11时苍组图12时柴组图13时金组图14时龙组图15时少组图16时十组 图17时左组图18功对组图19功苍组图20功柴组图21功金组图22功龙组图23功少组图24功十组图25功左组33证候判定无论是基准辐射，还是加功辐射、加时辐射，金匮肾气丸对其全部精液参数都有显著疗效，同时，金匮肾气丸还可以改善微波辐射损伤的小鼠睾丸组织病变；其他方剂仅对部分精液参数有疗效，而且对辐射损伤睾丸的病理变化无改善，因此，微波辐射性雄小鼠生殖功能障碍的证候是肾阳虚证。4讨论中医临床用药，离不开辨证论治，中医证候对中医临床至关重要8。经验表明，中医中药治疗微波辐射性男性不育症有效，但只有辨清微波辐射性男性不育症的证候，才能更好地
