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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划酵母菌耐酒精能力实验报告果酒酵母的分离纯化及选育果酒是利用新鲜水果为原料，在保存水果原有营养成分的情况下，利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生理活性物质，经常适量饮用具有一定的保健作用。酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，决定果酒品质的优劣。果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母，前者的应用提高了果酒酿造的生产效率，后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的
2、影响。野生型果酒酵母经分离纯化后，结合诱变、杂交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术，其酿造性能显著提高，酿造的果酒品质明显改善，因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。本实验选用葡萄为原料，分离纯化了3株酵母菌，并对其筛选使其适合果酒酿造。一、实验目的1、学习掌握果酒酵母分离纯化的方法；2、对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。二、实验原理酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为712m，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母应具备下列性能：1、除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。2、生长速度快，有较高的发酵能力，能
3、将糖分全部发酵完。3、具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。4、培养基成分简单，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。5、能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。由此可见，酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高，因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养，通过设置较高的酒精
4、浓度、添加SO2、调整pH等手段抑制不需要的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖。酵母检出后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。三、实验仪器与材料富集培养基：乳酸马铃薯葡萄糖培养液：马铃薯200g，葡萄糖20g，乳酸20g，蒸馏水1000ml酿酒酵母培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，制法同上。器具：15个培养皿、12支试管、4个100ml锥形瓶、3个250ml烧杯、30个试管、30个杜氏管、1个试管架、7个三角瓶，无菌滴管，接种环，
5、酒精灯，玻璃涂棒，冰箱，高温灭菌锅，水浴锅，显微镜，血球计数板，恒温培养箱、恒温摇床。四、实验内容及步骤1、酵母的分离与纯化接种：取成熟的苹果的小块果皮直接接入250ml锥形瓶含有150ml的乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，需要三组，置于28摄氏度恒温摇床中，转速为120，震荡培养48h；将苹果果皮研磨直接接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，需要三组，置于29摄氏度恒温培养箱中，培养48h；培养：用无菌吸管吸取上述培养后培养液1ml，置于9ml的无菌水中，稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5；分离、纯化：马铃薯葡萄糖培养基溶化后制成平板，用1ml的无菌吸管，分别吸取10-3、10-4、1
6、0-5置于培养基表面，用无菌的玻璃涂棒迅速涂抹均匀，培养基做好标记，放于恒温培养箱培养大约两天，培养基倒置，菌落长出后，观察其菌落并用显微镜查菌体数。一般一个单独的菌落可视为一个细胞发育而来，是纯培养，如果结构复杂未得到纯培养，可进行再次分离培养知道纯化为止，步骤如下：A.将融化了的马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿中，每皿大约15ml，冷凝成平面，记上标记；B.用平板划线法接种右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，挑取菌体培养物少许。左手斜持琼脂平板，于火焰近处将菌涂于琼脂平板上端，来回划线，涂成薄膜，划线时接种环与平板表面成3040o角，轻轻接触，以腕力在平板表面行轻快地滑移动作，接种环不应
7、划破培养基表面。烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷，从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面五分之一左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。划线完毕，盖上皿盖，底面向上，用标签注明菌名和组名，置恒温箱中培养，长出菌落即可。2、酵母的筛选与保藏酵母菌种的复筛发酵力实验：取100ml三角瓶，各加入80ml果汁，置于80摄氏度的水浴杀菌5min，冷却到30摄氏度后，按每升接种30ml的比例分别接入酵母种子液，在20摄氏度下发酵。发酵过程中每24小时测定1次三角瓶质量，确定菌株发酵力的强弱。酵母菌的耐受性试验1.用配好的PDA液体培养基，将培养基分别倒入试管
8、与三角瓶中，试管每支10ml，共300ml，三角瓶每瓶50ml、共350ml。再将三角瓶和试管在121高温下灭菌30min。杜氏管倒置放入试管中，保证杜氏管中没有气泡。2.采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇、二氧化硫的耐性。按下表在试管中加入果汁。然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，11520min灭菌。灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。最后在每个编号试管中接入对数期酵母1107个，28静止培养。观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。将标签贴于各试管上，标10、12、14、16、18，按下表每管加入果汁量：试管编号95%酒精/mL果汁/mL培养液含酒精%00
9、100101012121414161618182020按亚硫酸含量为6%计，计算出60、100、120、180、240mg/L浓度所需的量，分别加入到果汁中制成SO2不同浓度系列的液体培养基。按下表加入果汁，然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，11520min灭菌。灭菌完后，待试管温度常温后按上表加亚硫酸，加完后摇匀。最后在每发酵管中接入对数期酵母1107个，28静止培养。观察产气情况，选出耐SO2比较好的菌种。将标签贴于各试管上，标1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量：试管编号亚硫酸/uL果汁/mL培养液含SO2mg/L001003XX120将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同
10、浓度二氧化硫的果汁培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况。五、实验结果：发酵力实验：耐受性实验：菌株2：实验方案酵母菌酒精发酵的条件研究学院：生物与化学工程学院专业：生物工程学生姓名：鑫学号：班级：生物工程二班指导教师：肖一、实验目的1、学会实验的设计和操作过程2、找到酵母菌发酵时的最优条件二、培养基和实验方法及材料的确定1、玉米粉的糖化方法玉米粉的糖化采用双酶法，其工艺流程如下玉米粉加水液化糖化发酵蒸馏成品酒精试验中，发酵培养按照三角瓶100ml培养。本次工做20组是要，共需发酵液20*100=XXml。培养液按照100g玉米粉、300ml水。所以共需玉米粉700g。液化：取玉
11、米粉，加入的水，液化温度为，值为，液化时间为，液化酶的添加量为玉米粉糖化：糖化时的工艺条件为：糖化温度为，值为，糖化时间为，糖化酶的添加量为玉米粉。2、活化培养基本实验在进行实验时采用察氏(czapck)培养基的配制，配方如下表一：表一3、扩大培养基扩大培养仍然用察氏(czapck)培养基，由于要用液体的，所以将其中的琼脂配料去掉。4、发酵培养基糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料，灭菌三、培养基的制备及酵母的活化1、准备酵母母菌一支常温下存放一天，增加菌种的活力。在母菌存放期间制作各时期培养基2、准备固体培养基50ml，做成8支试管斜面，扩大培养基800ml。做成8个三角瓶，每瓶200ml。12
12、0灭菌30min。3、发酵液的制备玉米粉的筛选实验前准备粉碎后的玉米粉700g。玉米粉的液化按照100g玉米粉、300ml水的配比对玉米粉进行液化，液化方案上文已经交代。在1000ml烧杯里，或者500ml烧杯分两次，水浴液化。器材：烧杯500ml两个，玻璃棒一个，水浴锅一个，糖化酶步骤：1、将糖化酶，玉米粉，水按照比例配置好在烧杯里。2、将配好的玉米液放于水浴锅中90液化。边液化边搅拌。玉米粉的糖化将液化后的玉米液中按照/100ml加入液化液中。再在水浴锅中，58糖化。过滤糖化后的糖化液有可能有没有彻底液化的玉米颗粒，会造成浑浊，这时需要对糖化液进行过滤操作。操作步骤：最后与以上培养基一起进
13、行灭菌处理。灭菌时，清洗16支移液管，与培养基一起灭菌。活化步骤器材：酒精灯，接种针，母菌，斜面培养基，消毒酒精。步骤：1、将器材放于实验台上。对双手合桌面进行灭菌。对接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁按照无菌操作步骤在酒精灯火焰旁取下试管棉塞。3、将灼烧后的接种针伸入母菌试管取粘取少量母菌，粘取前将接种针放于试管内壁，冷却56s。4、按照无菌操作将取过母钟的接种针移入活化试管内并画曲线。5在酒精灯火焰旁将试管棉塞塞上，塞前将棉塞烧一下。如此接种八支试管。并保存28培养2d。四、酵母的扩大培养器材：液体培养基，活化后菌种，酒精灯，接种针，消毒酒精。步骤：1、将器材放于试验台上，并对双手和桌面灭
14、菌，接种针进行灼烧灭菌。2、在酒精灯旁取下棉塞，并用接种针接种少量菌种于液体培养基内。3、在酒精灯旁塞好棉塞，并于28培养。根据发酵单因素的不同，确定培养时间。其中变量是菌龄的一瓶瓶号1、2要求培养时间分别为：对数期1：1516h，对数期2:1618h，缓冲期：2024h，稳定期：2426h。其他菌种培养20h进行接种。五、发酵培养1、不同菌龄下的发酵器材：扩大菌种的四个不同阶段即对数期1：1516h，对数期2:1618h，缓冲期：2024h，稳定期：2426h。移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球。步骤：1、将对数期1的菌种和其他设备放于实验台上。2、用移液管按照发酵液的10%的比例移取扩大培
15、养液到发酵液中。3、塞好棉塞将发酵液放于30条件下培养2d。4、按照以上步骤将不同菌龄的扩大菌种移接到发酵液中进行发酵培养。之后进行酒精检测。2、不同菌量下的发酵器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球。步骤：1、将实验器材放于实验台上。2、用移液管移取8%的扩大菌种到发酵液中。3、塞好棉塞，将发酵液存放于30条件下发酵2d。4、按照以上步骤，分别移取10%、12%、14%的扩大菌种到发酵液中，30培养2d，之后进行酒精检测。3、不同醪液浓度下的发酵器材：扩大菌种，移液管四个，酒精灯，发酵液，洗耳球。步骤：1、将实验器材放于实验台上。2、用移液管移取10%的扩大菌种到4个发酵液中。3、制作不同浓度的醪液，分别按照1:2,1:3,1:4，1:5。3、塞好棉塞，将四个发酵液三角瓶编号1、2、3、4。将发酵液
