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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划酪蛋白检测实验报告一实验原理蛋白质浓度的测定考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当他与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G250蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感性。在一定范围内，考马斯亮蓝G250蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可用于蛋白质浓度的测定。二实验设备与试剂设备：普通离心机，721型分光光度计试剂：
2、标准蛋白液三实验材料新鲜绿豆芽四实验内容1.标准曲线的制备取9支干净的试管，按表进行编号并加入试剂。2.样品蛋白的测定样品蛋白液制备准确称取2g新鲜绿豆芽胚轴的部分，研磨成匀浆，离心分离。取上清液用%nacl定容到10ml。含量测定另取两只干净的试管，加入样品液，和考马斯亮蓝染液，混匀。室温静置3min，与波长595nm处比色，读取吸光度。五实验结果1.标准曲线结果如表所示，并以吸光度为纵坐标，个标准液含量为横坐标做标准曲线。2.样品蛋白含量的测定样品蛋白的比色结果如表，根据直线方程求出每支试管中蛋白质含量。样品蛋白的体积蛋白质含量=测定时取样的体积称取样品的重量六结果与讨论结果：绿豆芽蛋白质
3、含量=/g讨论：1.试液为混合均与就取样2.量取溶液时读数有误差3.读取A值时有读数误差4.比色杯中的误差根据公式求出样品绿豆芽蛋白质含量实验一蛋白质分子的测定凝胶层析法一、实验原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，小分子可以进入凝胶内部，流苏缓慢，一直最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得以分离。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，其内部都具有很微细的多空网状结构
4、。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶。其中葡聚糖凝胶是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。Vt由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo为“孔隙体积”、“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积；Vg为凝胶本身体积；Ve为洗脱体积，即自加入样品时算起到组分最大浓度出现时所流出的体积，Ve与Vo及Vi之间的关系为：Ve=Vo+KdVi，；Kd为样品组分在二相间的分配系数，Kd=(Ve-Vo)/Vi，有效分配系数为K
5、av，Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)。在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析的特点，与一般层析方法不同。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系为：Ve=K1-K2logM，K1与K2为常数，M为分子量，通常用Kav代替Ve，建立标准蛋白质分子式量LgM与Kav的标准曲线，称为“选择曲线”。在允许的工作范围内，曲线越陡，则分级越好，而工作坊为越窄。凝佼层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物，如球蛋白类，右旋糖酐
6、类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的Mr，测定时以使用曲线的直线部分为宜。二、试剂材料试剂1、标准蛋白质：蓝色葡聚糖，牛血清蛋白，胃蛋白酶，CytC(分子式量13700)。2、洗脱液：/LTris-HCl-KCl，3、SephadexG-75。器材1、层析柱：柱管40cm。2、紫外分光光度计。3、部分收集器。4、刻度试管。三、实验步骤1凝胶装柱：先将洗脱液缓慢导入柱管内，然后将处理好的凝胶溶液加入层析管中。等到凝胶层胶面快接触到管顶端时，将洗脱管接好，洗脱30分钟，直到凝胶柱稳定。2调试液滴速度：将洗脱液速度调节至每分钟17滴，将时间定在分钟自动调换试管，为加样收集洗脱液做准备。
7、3加样：当液滴速度稳定在17滴每分钟之后，将层析管打开，用胶头滴管吸走多余的洗脱液。此时将蓝色葡聚糖沿管壁加入凝胶层，同时用夹子夹住洗脱液出口，当葡聚糖加完之后，松开夹子，记录蓝色葡聚糖达到层析管低端的时间，此时收集的洗脱液体积即为Vo，Vo=VeI。此时用夹子夹住洗脱液出口，重复上述步骤，添加牛血清蛋白质。按照上述方法将4种标准蛋白质样本依次加入层析管中层析。需要注意的是，需记录每次加样的试管号，以便计算各种物质的洗脱液体积，以后每加一种蛋白质的时间都要比上一种蛋白质添加时间间隔长；用分光光度计测定各试管洗脱液吸光度值，标出各个峰值，第二次加样到第二个峰值出现的各试管洗脱液的体积即为VeII
8、，第三次加样到第三个峰值出现的各试管洗脱液的体积即为VeIII,第四次加样到第三个峰值出现的各试管洗脱液的体积即为VeIV。4记录上述试验各部实验数据，建立有效分配系数Kav和洗脱液Ve标准曲线。四、实验结果实验过程中，记录实验试管编号和每个试管的洗脱液体积，以及相对应的吸光度值如下表所示：表1凝胶层析实验原始数据试管编号133435单管洗脱液体积/ml洗脱液总体积/mlA280nm142利用ExcelXX绘制洗脱液总体积吸光值散点图，见图1。和实验操作一样，有4个峰值，分别为蓝色葡聚糖、牛血清蛋白、胃蛋白和CytC。从中可知，V0=VeI=，VeII=，VeIII=，VeIV=。图1凝胶层析
9、洗脱液体积与对应吸光度值散点图建立标准蛋白Ve与与LogM标准曲线，见表2、图1。相关系数R2=，相关性较好，可作为为测定未知蛋白的标准曲线。因此最终的标准曲线为：Ve=-LogM+。表2各标准蛋白Ve与logM值蛋白质种类VelogM葡聚糖牛血清胃蛋白CytC图2蛋白质Ve与LogM的线性图五、分析与讨论1在允许的工作范围内，曲线越抖，则分级越好，本实验选择曲线斜率为-，曲线很陡，说明此蛋白质的分级很好。2从洗脱液总体积吸光值散点图看，除了4个标准品的峰外，在葡聚糖之前、胃蛋白和CytC之间均出现了很小的波峰，干扰实验结果分析。出现这种情况的原因可能是加样不均匀或者仪器本身不稳定等。3实验的误差原因及注意事项有:凝胶干粉要充分溶胀；层析柱粗细要均匀；连续用的小乳胶管不能有破损；实验过程中要保持层析柱液面水平；加样的浓度和粘度要适中；洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同；收集的溶液体积测量要准确等。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。
