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1、循环肿瘤标志物（CTC）检测技术在肺部小结节诊断中的最新进展,格诺生物 刘双,Lung Cancer in Solid Tumor in China,LDCT筛查降低肺癌死亡率,NLST research team. NEJM, 2011,胸部CT筛查与过度诊疗的悖论,大部分非实性成分的结节为良性疾病,26.2% 自行消失,仅3% 确诊为肺癌,将所有肺部结节计算在内，假阳性率为21.8%-26.6%左右,Pinsky FR, et al. Ann Intern Med, 2015,比较了两个大型临床研究的假阳性率 NEJM发表的NLST研究中假阳性率第一次筛查为26.6%，第二次筛查为21.8
2、%,如何解决？,第1-3次胸部CT筛查相比，第4次行胸部CT时 I期肺癌的比例下降20%,如何解决？,PET-CT对于肺部良性结节，假阳性率约45%,Veronesi G, et al. Ann Int Med 2012,如何解决？,创伤性检查 不良反应大 部分患者无法耐受,肺癌病理活检局限性,成本高,术后并发症 对于部分年老或合并基础疾病的患者,如何解决: 能否有更敏感的肿瘤标志物来帮助诊断,液态活检在肺癌中的应用,治疗策略,事件,疑似肺癌,辅助诊断,早癌肺癌,晚期肺癌,癌症耐药,复发监测,治疗方案选择,耐药机理 新药研发,CTC的临床应用价值,疗效评估,CTC(数量） (负向富集+靶向PC
3、R）,ctDNA (基因变异）,1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015,什么是循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）？,肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少，可间接反应肿瘤发生发展的功能状态,CTC：在肿瘤发生过程中，具有干细胞特征的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞，均由原发肿瘤脱落释放入外周血，两者统称循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell）CTC1,CTC有转移：侵入第二器官CTCs，称之为DTC（d
4、isseminated Tumor Cell），只有由具有干细胞特征的DTC所形成的微转移灶，逃避免疫识别才可能发展成为肿瘤远处转移2,CK+ cells,HER-2+ cells,第9周的乳腺管组织切片：乳腺管周围非典型性增生,第30周的肿瘤组织切片：新生的肿瘤上皮细胞形成牙槽并侵袭周围基质,什么时候可以检测到CTC？,早期肿瘤外周血中即可检出CTC,W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007,早期肿瘤外周血中即可检出CTC,表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面 移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大
5、约1.4个CTC细胞 移植后第3和第4周，则每分钟可分别检测7个和18个CTC，随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升 在肿瘤移植的前4周内，没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象,CTC富集技术 密度与大小 免疫磁珠（负向富集 or 阳性富集) 微流体,CTC 检测方法,CTC检测技术 靶向PCR 免疫荧光 普通PCR,=,+,“方法”,“收获”,“垃圾”,蟹饵,没水了， 我们躲不了了,放 水,负向富集,优势：回收率100% 劣势：纯度略低,幸好没贪嘴， 我们逃了,“方法”,“收获”,“垃圾”,没水了， 我们躲不了了,放 水,负向富集,优势：回收率100% 劣势：纯度略低,幸好没吃胖， 我们
6、逃了,网 筛,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术,负向富集,靶向PCR,FR阳性靶标,肺癌细胞FR(叶酸受体）高度表达 CTC：FR=1:50万 EMT转化不影响FR丰度 其他血细胞不表达FR,CTC回收率接近100% 磁珠富集易操作和自动化,灵敏度超高，负向富集即可检测 信号二次放大，1: 1012倍放大 无需人工经验判读，结果客观准确 可实现CTC的定量,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测,格诺CytoploRare 灵敏度最高的检测技术,特异性DNA PCR扩增-提高敏感性 FR靶向：高特异性探针 1 CTC in 6,000,000（可在600万个背
7、景细胞中检测出一个CTC）,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测 靶向PCR，信号放大，保证高度敏感性,1个CTC信号放大1012倍,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测 敏感性试验：1ctc in 1,200,000白细胞,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107） FR靶向PCR CTC检测技术的回收率接近100%，且呈线性分布 检测灵敏
8、度约为5.09/（1.23*107）=1/240万600万,将不同数量的FR阳性肿瘤细胞分别掺入3ml全血(1.2-3.0X107） 检测灵敏度约为5.09/（1.23*107）=1/240万600万,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测 敏感性试验：1ctc in 6,000,000白细胞,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术 FR（叶酸受体，高度特异性的靶向探针）,特异性高：加入FR靶向探针前，加入高浓度叶酸封闭细胞表面的叶酸受体，检测结果为阴性,背景表达：去除FR靶向探针，仅保留特异性DNA
9、片段，与保留FR靶向探针相比，检测结果一致，提示背景可能为特异性DNA片段所致的固定值,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,2004,Cell Search: 乳腺癌中检测出，但肺癌敏感性低,2011,Cell Research: 采用的抗体(EpCAM)对EMT细胞特异性差，而肺癌细胞转移入血需要EMT的过程,EpCAM阴性细胞中，存在大量CTC,Cell Research系统主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做为探针 研究证实，EpCAM阴性的细胞中也存在CTC,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,有报道，部分激活的巨噬细胞存在F
10、R的高表达1 临床前研究证实，这部分巨噬细胞很少在正常人的外周血中出现2 使用抗CD14免疫磁珠去除巨噬细胞后，CTC的检测结果无明显改变3,1、He W, et al. Int J Cancer 2008; 2、He W, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007; 3、Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术 巨噬细胞（可能存在FR表达）不影响检测结果,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,CytoploRare FR靶向PCR CTC检测技术 同一患者重复检测
11、，可重复性高,CytoploRare,敏感性 特异性 可重复性 临床应用便捷性,3mL血6个小时得到报告,检测流程,肺癌领域，CTC检测技术对比,1210例受试者,肺癌 560例,肺部良性疾病 350例,其他肿瘤 (150例) 肝癌 30例 结直肠癌 30例 乳腺癌 30例 胃癌 30例 食管癌 30例,331例A 100例B 50例C（21例D) 79例D,A: 基线CTC检测 B：术前术后CTC监测 C：一线含铂双药化疗中CTC监测 D：基线CTC、CEA、CYFRA21-1、SCC、NSE检测,300例A 50例D,健康人 150例,100例A 50例D,150例A,非动态研究 肺癌 5
12、60例A 肺部良性疾病 350例A 健康人 150例A,动态监测研究 非小细胞肺癌 100例B 50例C,对比研究 肺癌 100例D 肺部良性疾病 50例D 健康人 50例D,肿瘤特异性研究 其他肿瘤 150例A,FR靶向PCR CTC检测技术 临床试验设计（1210例, 全国肺癌CTC研究最大样本量）,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,参加单位： 上海市肺科医院 上海市胸科医院 医科院肿瘤医院,42,患者特征,Jiatao Lou,
13、 et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2012; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,FR靶向PCR CTC检测技术 叶酸受体阳性CTC作为肺癌诊断的标志物,43,最大样本量CTC检测数据 Cutoff： 8.70 CTC Units/3mL 敏感性：79.6% 特异性：88.2%,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013; Yue Yu, et al. Transl Oncol 2013; Xiaoxia Chen, et al. JTO 2015,AUC: 0.8797,FR靶向
14、PCR CTC检测技术 敏感性高 I期肺癌敏感性67.2%,NSCLC患者与对照组的CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCC-AgROC曲线分析,不同标志物在NSCLC和I期NSCLC患者中的灵敏度,不同标志物在对照组的特异度,FR-CTC、NSE、CEA、CA125、Cyfra21-1、SCC-Ag对NSCLC和早期NSCLC患者的诊断效率,Yue Yu, et al. Transl Oncol 2013,1cm肺癌总体敏感性: 62.5%,CTC联合CT可以大大提高小结节诊断的特异性 CTC辅助CT可以将小结节的判别假阳性率降低到10%,Lou JT, Wang L,
15、 et al In submission,上海市胸科医院：病例一,VATS右肺上叶切除术：右肺上叶细支气管肺泡癌（非粘液性），T1aN0M0， 直径0.8cm,VATS右肺上、中叶切除+系统性淋巴结清扫： 术后病理确诊：右上叶腺癌（非粘液性）、细支气管肺泡癌及肺泡样混合亚型，高分化， T1aN0M0 肿瘤大小：0.5*0.7*0.4cm,上海市胸科医院：病例二,FR靶向PCR-CTC检测显著优于一般肿瘤标志物：可帮助肺部小结节鉴别诊断,总结,LDCT筛查可降低肺癌死亡率，但也导致部分过度诊疗问题，手术 or 随访？ 目前各种鉴别诊断方法各有利弊 手术活检：创伤大 随访：升期的风险 PET-CT：假阳性率高，1cm无法有效检出 FR靶向CTC检测技术优于一般血清学标志物可帮助无创鉴别诊断肺部小结节 I期肺癌敏感度可达68%左右,目前常规检测肺癌转移和评价治疗效果的方法主要是胸部CT 胸部CT只能评价肿瘤的大小部位，无法评估肿瘤的动态功能 FR受体靶向CTC检测做为三倍敏感度的新一代肿瘤标志物，敏感度更高，可用于评估肿瘤发生发展状态。 CTC联合胸部CT， 更全面的评估肿瘤,
