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1、年级：2012级 专业：麻醉学 班级：麻醉班,设计性实验报告,第三实验室 第四组,时间：2013年6月11日星期一,报告人：谢俊雄,组员：计树雄、黎国燕、李玲、罗靖、王玺赟、 王玉宣、谢俊雄、雍雪进、张茜、李俊,案例分析,案例分析,案例：患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样（发生溶血性贫血）色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。体格检查：体温38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩c膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛
2、，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.981012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5mol/L，结合胆红素13.7mol/L，未结合胆红素71.8mol/L，尿蛋白（+），潜血(+)，尿胆红素()，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。,红细胞 1.981012/L （6.0-7.0）1012/L 血红蛋白 53g/L （170-200)g/L 血清总胆红素 85.5mol/L （3.4-17.1）mol/L 结合胆红素 13.7mol/L 03.42mol/L 未结合胆红素 71.8mol/L 013.68mol/L 尿蛋白（+） 潜血(+)尿胆红素()尿胆素原(+),实
3、验室检查项目,正常值,患儿检查值,案例分析,体温升高,B:40bpm 呼吸急促,蚕豆病,红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症1,案例分析,设计实验,G6PD基因分析,G6PD确诊试验,红细胞G6PD活性测定,G6PD荧光斑点试验,G6PD筛选试验,高铁血红蛋白还原试验,特异性不高,国际血液学标准化委员会 (ICSH)推荐,实验设计,G6PD荧光斑点试验2,G6PD,实验原理：葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光。所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀，通过观察滤纸上有荧光出现时间
4、可判断G6PD活性。,NADP NADPH,G6P 6PGA,实验原理,340nm紫外线,荧光,试剂：10mmol/L G6P钠盐、7.5mmol/L NADP、1g/dL皂素、250mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4），蒸馏水,仪器：长波紫外灯、滤纸、水浴箱,G6PD荧光斑点试验,实验流程,G6PD荧光斑点试验,1反应液的配制：10mmol/l G6P钠盐0.1ml、7.5mmol/l NADP0.1ml、1g/dl皂素0.2ml、250mmol/l磷酸盐缓冲液（pH7.4）0.3ml，蒸馏水0.3ml混匀。其中除皂素外，均可于4下保存半月，皂素必须新鲜配制。反应混合液在室温和冰箱中均不易
5、保存。因此最好在临用前根据用量临时混合。,3.取试管，加10l全血+100l反应液，混匀，取一滴于滤纸上（第一斑点 ）作为对照；,2.将上液置于37水浴10min ，再取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）实验组 ；,4.晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果并计时 。,实验流程,G6PD荧光斑点试验,正常人： 0min斑点无荧光，5-10min出现，10min荧光最强临床诊断：轻度缺陷者：0-10min荧光很弱或不出现中度缺陷者：10-30min出现荧光严重缺陷者：30min内不出现荧光,结果分析,G6PD荧光斑点试验,红细胞G6PD活性测定,实验原理：基本原理同G6PD荧光斑点实验。不同的是
6、利用紫外光分光光度法定量测定酶活性，即每隔一分钟在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度（测6次），求每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内NADPH生成由于所用试剂及体系的不同。方法：WHO推荐的Zinkham;NBT定量法等,实验原理,G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法 ),试管 对照管 测定管,NADP液（ml） 0.1 0.1 Tris液（ml） 0.1 0.1 氯化镁液（ml） 0.1 0.1 蒸馏水（ml） 0.68 0.58 G6P液（ml） 0.137预热 溶血液（l） 20 20,立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的
7、变化,实验流程,红细胞G6PD活性测定,计算公式：G-6-PD活性（U/gHb）=A/min1000/6.221020/20 Hb(gL-1),A/min:每min吸光度的平均变化值1000/6.22:为微摩尔消光系数1020/20:总容量与溶血液的量之比；,实验流程,红细胞G6PD活性测定,G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以 上即可作出诊断,方法 正常值范围,WHO推荐的Zinkham (12.012.09)IU/gHb(37) ICSH推荐的Glock与McLoan法 （8.341.59）IU/gHb(37) NBT定量法 （13.130.0）NBT单位 Chapman和D
8、ern法 （2.87.31）IU/gHb(25),结果分析,红细胞G6PD活性测定,从生化代谢解释患儿的 临床表现和实验室检查结果3,GSH的主要作用： 保护红细胞内的含硫氢基 （-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜蛋白的完整性，免遭氧化 与谷胱甘肽过氧化酶共同使H2O2还原成H2O,红细胞膜破裂,溶血性贫血 （面色苍白）,游离Hb肾吸收阈值,血红蛋白尿/含铁血黄素尿,G6PD,NADPH+H+,GSH,红细胞的抗氧化能力,血尿、酱油样尿液,皮肤及巩膜黄染,红细胞 1.981012/L （6.0-7.0）1012/L 血红蛋白 53g/L （170-200)g/L 血清总胆红素 85.5mol/L （
9、3.4-17.1）mol/L 结合胆红素 13.7mol/L 03.42mol/L 未结合胆红素 71.8mol/L 013.68mol/L 尿蛋白（+） 潜血(+)尿胆红素()尿胆素原(+),实验室检查项目,正常值,患儿检查值,案例分析,体温升高,导致患儿体温升高,具有载氧能力的 Hb含量下降,呼吸急促,讨该病发生的分子基础， 可以用哪些技术检测什么目的基因 ？4,检测G6PD基因,此外还可以用通过扩增葡G6PD基因第10，11，12，13外显子639bpDNA片段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术、PCR/SSCP分析法、DNA序列分析、探针技术等方法检测上述基因的点突变。,体型瘦小与该病症的相关性,营,养,物,质,运,输,不,足,相关,参考文献,1红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症OL http:/ 2陶元鋆 倪福椿 邹俊伦 童若春.简易G6PD荧光斑点试验J.临床检验杂志,1983(03) 3查锡良等.肝的生物化学Z.生物化学，第七版：419432 4蚕豆病的基因检测方法 OL http:/ you!,
