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1、,蛋白质的电泳分析 SDS-PAGE & Western Blot,蛋白组学平台,提问：RT-PCR、WB、免疫组化、FCM、ELISA、Bio-plex 用来检测什么？有何区别？,SDS-PAGE 蛋白分析的利器； Western 既可以定性，又可以半定量,是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。,Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。是检测混合样品中单一特定蛋白的常用技术。,灵敏度可以达到1-5pg.,研究检测样品中特异性蛋白质的存在细胞中特异蛋白质的半定量分析蛋白质分子的相互作用研究,Western Blot 应
2、用,总蛋白的提取,材料：HT-29细胞（收集25cm培养瓶一瓶） 试剂：RIPA蛋白抽提试剂 （裂解液有多种，根据需要选择） 检测 beta-actin，分子量43KDa 注意：为防止蛋白酶对蛋白的降解，提前前需加入1x coaktail (含PMSF)，冰中 操作。,PMSF: 丝氨酸蛋白酶抑制剂【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。 【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。 PMSF在水中不稳定，故需在使用前再加
3、PMSF；PMSF低温时会有冰晶，用时要摇匀至无结晶。,Procedure for Lysis of Monolayer-cultured Mammalian Cells Note: If desired, add protease and phosphatase inhibitors to the RIPA Buffer immediately before use. 1. Carefully remove (decant) culture medium from adherent cells. 2. Wash cells twice with cold PBS. 3. Add cold R
4、IPA Buffer to the cells. Use 1mL of buffer per 75cm2flask containing 5 106 HeLa or A431 cells. Keep on ice for 5 minutes, swirling the plate occasionally for uniform spreading. 4. Gather the lysate to one side using a cell scraper, collect the lysate and transfer to a microcentrifuge tube. Centrifug
5、e samples at 14,000 g for 15 minutes to pellet the cell debris. Note: To increase yields, sonicate the pellet for 30 seconds with 50% pulse. 5. Transfer supernatant to a new tube for further analysis.,Protocol,1、贴壁细胞，去培养基，加入2ml预冷的PBS，洗2-3 次，最后移至EP管中，用滤纸弃干水分，25cm培养瓶一瓶加入120 L配好的含多种酶抑制剂的RIPA裂解液，用枪头轻轻将细
6、胞吹散，放在冰上裂解20-30min，期间可以用手弹一弹管子或者振荡数次以使细胞裂解充分。（注意不要引起过多气泡以免蛋白降解）。裂解完，14000转，4离心15分钟。取上清即得所需总蛋白。组织样品：按100 mg组织加1 ml的RIPA裂解液（含酶抑制剂），用玻璃匀浆器匀浆。冰中裂解，余同上。如果有些样品提时发现粘度较大（粘是因为含核酸多），可置于冰中进行超声数次；或者加核酸酶以降解核酸。 提完蛋白请分装（分装时一定要保证蛋白混合均匀），-80保存备用。 注意：不要全部变性，留些为变性的蛋白置于-80，以备用。 如果是检测磷酸化蛋白则提取时要加磷酸酶抑制剂。,在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结
7、构能与Cu2+ 络合，将Cu2+还原成Cu+。BCA 试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色复合物。在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。,绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。,定量完用裂解液/高纯水 根据测出的浓度将各种蛋白调至等体积， 一般可调至上样量为10-15 L,Pierce BCA Protein Assay Kit (Product No 23225).,蛋白样品与上样缓冲液（5x）按4:1的比例混合后，放在100加热器中加热3-5min （提前开机预热），充分变性蛋白后迅速降温，离心，一周内要做的存至-20，一 个月内要做的放于-80 冰箱。 如果蛋
8、白浓度很高的话也可以选择蛋白上样缓冲液（2x）。,1、应用于提纯过程中纯度的检测 2、用于分子量的检测 3、蛋白浓度测定（只跑浓缩胶，用已知浓度BSA对比）,SDS-PAGE的应用,SDS-PAGE原理,SDS,SDS与蛋白结合后，还可引起构象改变，复合物呈长椭 圆棒，SDS-PAGE只取决于蛋白分子量大小。,SDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 丙烯酰胺 (A)：形成聚合物链 N,N-亚甲双丙烯酰胺 (B) ：形成纵向架桥（cross-linkage） 过硫酸铵(APS，Ammonium persulfate) ：助凝剂 TEMED(
9、si)：催化剂,O CH2=CHCNH2,CONH2 CONH2 CONH CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCHCONH CH2 CONH CONH2 CONH2 CH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH CONH,(神经毒性),A,B,1、30%丙烯酰胺储备胶溶液 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.8) 3、1M Tris-HCl(pH 6.8) 4、10% SDS 5、10%过硫酸铵（AP） 6、TEMED (N,N,N,N-四甲基乙二胺) 7、2SDS电泳上样缓冲液 8、ddH2O,聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，
10、与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择Tris-HCl系统，具体作用后面介绍； TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固； 十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠（部分）。,蛋白质在进入分离胶以前，先被浓缩成一条细线， 使每个蛋白的起跑线相同，提高解析度。,分离胶孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，可以使样品很好的分离。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，
11、蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。,pH对整个制胶体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。,总体积：5mlddH2O 2.0ml 30%储备胶 1.65ml 1.5M Tris-HCl (pH 8.0) 1.25ml 10% SDS 0.05ml 10% AP 0.05ml 混匀上述液体后加4 l 的TEMED,SDS低温（10）下会结晶，冬天配胶时应注意。,1、清洗玻璃板，如果是第一次使用的波板，应用洗衣粉泡，超声，自来水冲洗完再用蒸馏水冲洗直至不挂水珠，晾干，装胶板，加入蒸馏水 ，静置10min观察是否会漏水，然后倒掉超纯水，
12、用滤纸吸干，应尽量吸干。 2、制胶（5+2）：根据蛋白分子量大小配好分离胶：12%分离胶常用按顺序加入各试剂至离心管中，加AP（10%）后，轻轻混匀，之后加TEMED迅速上胶，灌胶待胶面升到绿带中间线高度时即可，然后加满正丁醇/乙醇封住（为了使分离胶界面保持水平，将胶压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；并且阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用），让胶自然凝固。 3、待分离胶完全凝固后（约4560 min） ，倒去正丁醇/乙醇，用超纯水冲洗干净，滤纸吸干残留水滴。 4、加入浓缩胶至溢出，插入样品梳（稍微倾斜插入以减少气泡的产生），让胶自然凝固。 5、收胶：胶放在电泳液/水中于4度冰箱保存，拿出
13、来用时恢复到室温。,配 胶,操作时要使两玻璃对齐，左、右、底三边无间隙，尤其注意底边平齐，以免漏胶。 未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，要带手套并小心操作。 灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度，操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水或饱和正丁醇液封时要很慢，否则胶会被冲变型。 室温25下凝胶完全聚合约需30-60min。,积层/浓缩胶（4%）的配制 总体积：2ml ddH2O 1.4 ml 30%储备胶 0.33 ml 1M Tris-HCl (pH 6.8) 0.25 ml 10%SDS 0.02 ml 10%AP 0.02
14、ml 混匀后最后加TEMED 2 l 将混合液迅速加入玻璃板间隙，并立即插入梳子,插梳子时要使梳子保持水平并小心避免混入气泡。 由于胶凝固时体积会收缩减小，会使加样孔变形，所以在浓缩胶凝固的过程中要不断补充浓缩胶溶液使之充满梳子间的空隙。,2SDS上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。(缓冲液中溴酚兰染料，使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利；甘油还能够增大样品密度，以确保样品均匀进入样品孔内；SDS使蛋白变性并带上负电荷；-巯基乙醇还原蛋白。) 如果蛋白浓度
15、偏低则选择 5SDS电泳上样缓冲液,蛋白样品与上样缓冲液（5x）按4:1的比例混合后，放在100加热器中 加热3-5min（提前开机预热），充分变性蛋白后迅速降温，离心，一周 内要做的存至-20，一个月内要做的放于-80 冰箱。为了防爆管可在离心管上放 冰块。,四、电泳 1、将胶板装入电泳槽中，拔出样品梳（拔出来尽量小心,不要破坏加样孔, 如有胶丝可用毛细血管枪头挑出），清洗泳道。 2、将样品放置在冰上，融化后先离心，然后在振荡器上混匀，上样，上样量10-50ug，一孔加marker，在边缘孔中加入等体积的上样缓冲液 ，以避免边缘效应。 3、在电泳槽内加入足够的电泳液，插好电极，打开电泳仪电源
16、，以60v电压开始跑分离胶，到分离胶时，以80-120v跑胶，电泳至溴酚蓝到胶的边缘时结束。 注意： 1、电泳过程中随时检查内槽的电泳液是否会漏，槽应清洗干净，电极棒注意不能有结晶，线不能绕。 2、为减少小蛋白条带的扩散，上样后应尽快开始电泳；上样总体积建议为10-15 L，尽量不要超过25 。 3、加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。 4、为了获得更好的重复性，可配10或5X电泳液母液，用时再稀释。 5、由于变性完的蛋白放在冰箱中会发生复性，所以每次上样前都要进行变性分钟。 6、电泳前可先用10V预电泳10min使条带更平整。,
