高效液相色谱法简介

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1、2018/10/20,高效液相色谱法 （high performance liquid chromatography HPLC）,2018/10/20,1分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测 占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,一、HPLC 与GC的比较 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,2018/10/20,2流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作

2、用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性,2018/10/20,(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。,2018/10/20,四、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素,1. 涡流扩散项He,He2dp,2018/10/20,第一节 高效液相色谱仪,2018/10/20,液相色谱仪（2）,201

3、8/10/20,液相色谱仪（3）,2018/10/20,液相色谱仪（4）,2018/10/20,2018/10/20,流程及主要部件 process and main assembly of HPLC,1.流程,2018/10/20,2.主要部件,高压输液系统：一般由贮液器、高压泵、脱气、梯度洗脱装置 高压泵为主要部件之一，压力：150350105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,2018/10/20,(2) 进样装置,流路中为高压力工

4、作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,2018/10/20,(3) 高效分离柱,色谱柱是高效液相色谱仪的心脏，要求分离度高、柱容量大、分析速度快，高性能的色谱柱与固定相本身性能、柱结构、装填和使用技术有关。柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 标准柱型：内径4.6或3.9mm，长度为15-30cm不锈钢柱，填料5-10 mm，柱效7000-10000塔板数。,2018/10/20,(4) 检测系统,a. 紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm ，容

5、积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,2018/10/20,b. 光电二极管阵列检测器(PDAD,photodiode array detector ),紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，能快速同时检测从200900nm范围的全谱信息。计算机快速处理，三维立体谱图。,2018/10/20,c. 示差折光检测器 （differential refractive index detector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,特点： 通用型检测器；

6、灵敏度低； 对温度敏感； 不能用于梯度洗脱,2018/10/20,示差折光检测器,2018/10/20,d. 荧光检测器 （fluorescence detector）,特点：选择性检测器；高灵敏度、高选择性；适用对象：对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,2018/10/20,通用型检测器，用于检测挥发性低于流动相的任何样品。 可用于梯度洗脱 对温度变化不敏感,f. 蒸发激光光散射检测器（ELSD, Evaporation Laser scatter detector）,2018/10/20,质谱检测器 （mass spectroscopy）

7、,h. 电化学检测器：电导检测器、安培检测器等,2018/10/20,（一）、 液-固吸附色谱,固定相：固体吸附剂，如极性的硅胶和氧化铝，非极性的 苯乙烯-二乙烯苯基共聚物和石墨化炭黑微球，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,第三节、 高效液相色谱法的主要类型选择,2018/10/20,1. 环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶(37 50m)流动相：正己烷流 速：1.5 mL/min色谱

8、柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,2018/10/20,（二）、 液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography,固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；正相色谱：固定相-亲水性填料；流动相-疏水性溶剂或混合物反向色谱：固定相-疏水性填料；流动相-亲水性溶剂或混合物正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱,ODS），氰基柱（

9、正相）。,2018/10/20,（3）化学键合固定相,化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相；a. 硅氧碳键型： SiOCb. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c. 硅碳键型： SiCd. 硅氮键型： SiN,2018/10/20,2018/10/20,2. 稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水 100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min流 速：1mL/min柱 温：50 C柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器,2018/10/20,（三）、 离子交换色谱 ion-exchange ch

10、romatography,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,2018/10/20,（四）、 离子色谱 （ion chromatography， IC）,固定相： 离子交换树脂 流动相：

11、电解质溶液 检测器：电导检测器,R-H +Na+OH -,RNa + +H2O,R-H +Na+Br -,RNa + +HBr,抑制柱上的反应,分离柱：,2018/10/20,离子色谱的优点,（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；,（2）分离能力高在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。,（3）分离混合阴离子的最有效方法 （4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱,2018/10/20,3、离子色谱的应用,阴离子分析: 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流动相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.

12、0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。,2018/10/20,（五）、 离子对色谱 ion pair chromatography,原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，

13、试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,（六）、 排阻色谱色谱 size- exclusion chromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。组分全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,2018/10/20,2018/10/20,（七）、 亲和色谱(AC) Affinit

14、y chromatography,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,2018/10/20,二、分离类型选择 choice of separation types,2018/10/20,根据相对分子量选择分子量十分低的，挥发性好的样品，一般用气相色谱； 标准液相色谱类型（液固吸附色谱、液液分配色谱、离子交换色谱、离子色谱、离子对色谱）最适合的相对分子量范围是200-2000；

15、 分子量大于2000的，用排阻色谱。,2018/10/20,根据溶解度选择样品溶解与水且属于能离解物质：离子色谱、离子交换色谱、离子对色谱 样品可溶于烃类（苯或异辛烷）：液固吸附色谱 样品溶解于四氯化碳：常规的分配和吸附色谱 样品溶于水和异丙醇：常采用反相液液分配色谱,2018/10/20,根据分子结构选择异构体的分离：液固吸附色谱 不同官能团的化合物、同系物的分离：液液分配色谱 能离解的化合物： 高分子聚合物：尺寸排阻色谱,2018/10/20,第四节 HPLC的应用,生物化学和生物工程 医药领域 食品卫生 环境检测 精细化工 高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分

16、子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,医药研究方面的应用,2018/10/20,食品分析中的应用,糖类 酸类物质 维生素类 合成色素 食品污染物,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,2018/10/20,3.9 制备型液相色谱,制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱：内径2050mm，柱长50cm。,2018/10/20,液相制备色谱 preparative liquid chromatography,