细胞因子生物学活性检测

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1、细胞因子生物学活性检测细胞因子水平测定是细胞免疫功能检测的一个重要组成部分。由于许多细胞因子 cDNA 克隆和表达的成功，给细胞因子单克隆抗体制备、生物学功能的鉴定提供必要条件。目前 检测细胞因子水平主要包括两类方法：一是生物学活性的检测，这类方法是利用细胞因子 某一特定的生物学作用所设计的检测方法，如 IL-2 维持活化 T 细胞的增殖，IFN 能保护病 毒对正常细胞的感染，TNF- 选择性杀某些肿瘤细胞等，因此敏感性也较高；二是定量的 检测，常用酶联免疫吸附试验(ELISA)，如多克隆抗体与单克隆抗体，识别不同表位两种单 克隆抗体的双抗体夹心法，生物学和定量的检测方法各有优缺点，在必要时可

2、同时进行检 测。一、白细胞介素 1(IK-1)生物学活性测定白细胞介素 1 是一种重要的细胞因子，主要由单核-巨噬细胞产生，IL-1 不仅对多种 免疫活性细胞有重要的调节功能，而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。 目前对 IL-1 产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。ConA 刺激小鼠胸腺细胞检测 IL-1 生物学活性(一) 原理小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达 IL-1 受体，在有 IL-1 同时存在的条件下，IL-1 可 协同丝裂原促 T 细胞的增殖作用。根据加入 IL-1 后增殖水平(H-TdR 掺入率)的增加可计 算出样品中 IL-1 的活性单位，或计算出刺激指数。(

3、二) 操作步骤取 68 周龄 C57BL16 小鼠，拉颈处死，无菌取胸腺置不锈钢网筛上，用注射器针蕊研磨成细胞悬液调整细胞数为 1.510ml细胞悬液内加入 ConA，使终浓度为 3gml，在 96 孔培养板中加 100l(1.510细胞)加入不同稀释度待测样品和 IL-1 标准品100l孔(ConA 终浓度为 1.5gml) 37 CO孵箱 66h每孔加H-TdR 0.5ci37 CO孵箱 6h多头细胞收集仪收获于 9999 型玻璃纤维纸上烤干，移入液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测 计数计算:1. 从 IL-1 标准曲线上测得 IL-1 的活性单位2. 也可用刺激指数(SI)表示实验组

4、cpmSI 100对照组 cpm (三) 试剂和器材1. 10 FCS RPMI1640，96 孔培养板，CO孵箱2. 标准 IL-1， ConA3. H-TdR，PPO、POPOP，二甲苯4. 9999 型玻璃纤维滤纸，细胞收集仪5. 液闪计数仪(四) 注意事项1. 不同品系小鼠对 IL-1 的反应性有差异，据国内资料报道以 C57BL 为好。2. 不同周龄小鼠胸腺细胞对 ConA 反应性不一，一般选用 68 周龄，小于 5 周或大 于 10 周龄小鼠胸腺细胞对 ConA 反应不稳定。3. ConA 促丝裂原作用要进行预试，一般采用亚适剂量。应用 EL-4 CTLL 检测 IL-1 生物学活

5、性IL-1 是一种十分重要的免疫调节因子，同时也是一种可引起发热和导致多种病理损伤 的重要的内源性致热原和炎症介质。目前 IL-1 检测方法有多种，主要包括：小鼠胸腺细 胞法，黑素瘤细胞增殖抑制法，纤维母细胞法、T 淋巴细胞系法以及 EBV 转化 B 细胞法等。 原理：小鼠胸腺瘤细胞系 EL4 的某些亚克隆细胞表面具有高密度 IL-1 受体，在 IL-1 诱导下产生高水平的 IL-2，通过用 IL-2 依赖株 CTLL-2 检测 IL-2 的生物学活性，从 而反映检测样品中 IL-1 的水平。 操作步骤：1. 用 EL细胞两步法检测 IL-1 活性：收集处于对数生长期的 EL细胞洗涤后，用 1

6、FCS RPMI1640 重悬细胞，并调整细胞浓度 210/ml，加处 96 孔板中，100l/孔加入不同稀释度的 IL-1 或 IL-1，100l/孔，同时设 1FCS RPMI 1640 对照5CO,37培养 1824 小时按终稀释度为 11020 转入另一块 96 孔板中用 CTLL-2 检测 IL-2 活性、检测方法见“IL-2 检测“2. 用 EL4 细胞一步法检测 IL-1 活性用 5FCS RPMI 1640 调整EL4 细胞浓度至 210/ml，CTTL-2 浓度至 410/ml加入 96 孔板中，两种细胞各加 50l/孔加入不同稀释度的 IL-1 或待测样品，同时设 EL和

7、CTLL-2 细胞对照置 5CO,37培养 2428 小时后加入H-TdR,0.5ci/50l/孔,继续培养 68 小时 收集样品， 计数 试剂和器材1. EL细胞2. CTLL-2 细胞3. 标准 rIL-1。4. H-TdR、POPOP、PPO、二甲苯。5. 玻璃纤维滤纸，细胞收集仪。6. 计数仪7. 96 孔板，无菌吸管，滴管、试管及加样器头。8. FCS,RPMI 1640,CO培养箱等。 注意事项：1. 在一步法检测 IL-1 时，其 EL细胞浓度不宜超过 110/孔，血清终浓度应 5。2. 在二步法检测 IL-1 时，其 EL细胞浓度在 210/孔时，犉 d 转移上清稀释度不 宜低

8、于 18,其诱导时间应 1224 小时间为佳。诱导血清浓度应1。3. 在检测经诱导的上清中 IL-1 时，应避免使用 A23187，TPA 和 ConA 等较强的能诱导 EL细胞产生 IL-2 的诱导剂来刺激 IL-1 的产生。二、白细胞介素 2(IL-2)的生物学活性测定(一) 原理IL-2 主要由活化 T 细胞产生，又为 T 细胞增殖所必需，故称 T 细胞生长因子（ T Cell Growth factor, TCGF ）。IL-2 产生的水平反映 T 细胞的功能，牪;仅是免疫调节重 要的研究对象，而且与临床多种疾病密切相关，CTLL 是 C57BL6 来源的。犘!鼠杀伤性 T 淋巴细胞细

9、胞系，由 Gills 1977 年建立，只有在 IL-2 存在的培养基中才能生长。因此可 作为指示细胞来测定待检样品中 IL-2 的水平。除 CTLL 外，丝裂原活化的 T 淋巴母细胞亦 可作为检测 IL-2 活性的指示细胞。(二) 方法可根据实验室条件，选用H-TdR 掺入法和 MTT 法1. H-TdR 掺入法IL-2 依赖的 CTLL 用 10FCS RPMI1640 洗涤2 次，每次 1000rpm, 5min, 除去原培养液中的 IL-2调整活细胞数 110ml96 孔平底培养板中每孔加 100lCTLL 悬液(110孔)加入不同稀释度标准 IL-2 和待测样品37CO孵箱，培养 1

10、824h每孔加H-TdR 0.5ci50l 4-6h用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上干燥后，移入液闪瓶中，加入 1ml 闪烁液，于液闪仪中测 射线的 cpm 值计算(举例)将标准 IL-2 不同浓度和待测样品不同稀释度时所获得的 cpm 值作图，犠轴采用概率 座标(probit)，横座标为 Log2 稀释倍数。从 50的最高 cpm 值画一横线，犛 k 标准和待 检斜线的交点，即可计算出待检样品 IL-2 的活性单位。如标准品 50最大 cpm 值时为 1uml，则待测标本 14 时为 1uml,原液则为4/ml2. MTT 法MTT(3-(4,5-dimcthylthioazol-2-yl)-

11、2，5-diphenyl-tetrazolium bromide , 四甲 基偶氮唑盐)可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱 氢酶可将淡黄色的 MTT 还原成紫兰色的甲 (Formazan)，将结晶的甲 溶解释放，可根据 所测的 OD 值反映活细胞的数量和活性，从而推知待检样品中 IL-2 的水平。在掌握良好的 实验条件下，MTT 法的敏感性可接近H-TdR 同位素掺入法。IL-2 依赖的 CTLL 用 10FCS RPMI1640 洗涤 2 次，每次 1000rpm, 5min, 除去原培养液中的 IL-2调整活细胞数 1210ml96 孔平底培养板中每孔加

12、100lCTLL 悬液(1210孔)加入不同稀释度标准 IL-2 和待检样品，100l孔，每份设 3 个重复孔CO孵箱培养 1824h每孔加 10l MTT(5mgml 溶于 PBS) 4h，37轻轻吸出 150l 上清，加入 150l 二甲亚砜(DMSO)或酸性异丙醇(异丙醇溶于 0.04N HCl)溶解 10min，测 OD 值(570nM)(三) 试剂和器材1. IL-2 依赖的 CTLL2. 10FCS RPMI16403. H-TdR4. 标准 IL-25. MTT, 酸性异丙醇，二甲亚砜(DMSO)6. PPO，POPOP，二甲苯7. 9999 型玻璃纤维滤纸8. 96 孔平底培养

13、板9. 细胞收集仪10. CO孵箱11. 液闪计数仪(四)注意事项1. CTLL 细胞洗涤要充分，但操作必须轻柔，离心速度不宜过高，否则影响细胞的增 殖。2. 避免同位素污染。3. 加标准 IL-2 或待测样品时，按从低浓度到高浓度顺序加。4. 加入H-TdR 最适时机是阴性对照细胞开始全部死亡。5. CTLL 细胞冻存后复苏较困难，用含有丝分裂原条件培养基长期培养容易发生变异。三、白细胞介素 6(IL-6)生物学活性检测白细胞介素 6(IL-6)是一种具有多重免疫调节功能的细胞因子。HTLV-1 感染的 T 淋巴 母细胞系、单核细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞以及某些肿瘤细胞均可产生 IL-6

14、。某些 急性炎症、自身免疫性疾病、淋巴细胞恶性肿瘤(如多发性骨髓瘤)等与病人体内 IL-6 水平 异常增高有关。 原理：IL-6 在体外能促进 B 细胞杂交瘤的生长，故又称为杂交瘤生长因子(HGF)。 小鼠 B 细胞杂交瘤 7TD1 是一株对 IL-6 依赖的细胞系，由 Van Snick 1986 年建立，只有在 IL-6 存在的培养基中才能生长，可以作为指示细胞来测定待检样品中 IL-6 水平。这类 IL-6 依赖的小鼠 B 细胞杂交瘤细胞系还有 MH60BSF2、B9 等。 方法：主要为H-TdR 掺入法IL-6 依赖的 7TD1 细胞用无 FCS 的 RPMI1640 洗涤 2 次每次

15、 1000rpm，5min，除去原培养液中的 IL-6 用 10FCS-RPMI1640 调整活细胞数 210/ml 96 孔平底培养板中每孔加 100l 7TD1 悬液(210/孔)加入不同稀释度标准 IL-6 和待检样品(100l/孔)37，5CO孵箱培养 4872h每孔加H-TdR 0.5Ci/50l10h 用多头细胞收集仪收获于玻璃纤维滤纸上 干燥后移入液闪瓶中，加入 1ml 闪烁液，于液闪仪中测 射线的 cpm 值。计算：1. 根据 cpm 值，将能使 7TD1 细胞H-TdR 掺入 cpm 值达到最大值 50的 IL-6 的活 性定为 1u/ml。2. 以刺激指数(SI)表示。 试剂和器材1. IL-6 依赖的 7TD1 细胞系2. 10FCS-RPMI1640 及无 FCS 的 RPMI16403. H-TdR 4. 标准 IL-6 5. PPO,POPOP,二甲苯。6. 9999 型玻璃纤维滤纸。7. 96 孔平底培养板8. 多头细胞收集仪9. CO孵箱10. 液闪计数仪 注意事项：1. 7TD1 细胞洗涤要充分、轻柔，每次弃洗涤上清力求彻底。2. 避免同位素污染。3. 加样品时，应从低浓度到高浓度顺序加。4. 加入H-TdR 最适时机是阴性对照 95以上死亡。5. 为了增加检测方法的敏感性，可采用新复苏 7TD1 细胞，或用 pH4.0