《实验2：分离以尿素为氮源的微生物》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验2：分离以尿素为氮源的微生物（27页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验2 分离以尿素为氮源的微生物,思考：,采用什么方法从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物？ 如何判断分离出的细菌确实能将尿素分解？,一.实验原理,尿素 NH3中性 碱性酚红颜色： (酸性)黄色 红色,(变色范围 pH6.4-8.2),二.实验目的,使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌(有脲酶),通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基pH的变化(脲酶催化的化学反应),以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中尿素的分解，产生的NH3使培养基的pH由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红变成红色，菌落的周围会产生红色环带，红色环带愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强
2、。,三.实验步骤,.倒平板,.制备一定浓度梯度的细菌悬液,g土壤ml无菌水，振荡，为-2稀释液，依次制备 -3、-4、-5的土壤稀释液。,.稀释涂布分离法分离细菌,.制备无菌的全营养固体培养基和尿素固体培养基,.培养观察（倒置，37 24-48h）,（无菌，0.1ml，玻璃刮刀）,1、配制培养基,尿素培养基葡萄糖 0.025gNaCl 0.12gK2HPO4 0.12g 琼脂糖 0.5g酚红 0.25g尿素 10ml,选择培养基,实验组,为什么用琼脂糖代替琼脂？怎么获得无菌的尿素溶液？,琼脂和琼脂糖琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂糖和琼脂果胶，还含有少量的含氮化合物，及其它有机杂质和
3、不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是：其主要成分不能被微生物利用；可使培养基固化；不影响培养基中其他营养物质被细菌吸收。,实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被以非尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。,思考？,选择培养基,加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞,添加或缺少某种化学成
4、分用于菌种的分离,2、倒平板,制备空白平板：取2个三角瓶，分别装入已灭菌的全营养LB固体培养基和尿素固体培养基，放在超净工作台上，冷却至60 左右时，在酒精灯旁把上述两种培养基分别倒至培养皿中，轻轻摇匀，平放至凝固。,2、倒平板,在无菌条件下，在将1g土样加到装有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成10-2土壤稀释液，并依次制备出10-310-5稀释液。例如，若想制备10-3的稀释液，可取0.5 mL 10-2的稀释液。取样时，尽量只取悬液 ，倒入有4.5 mL无菌水的有盖试管中，摇匀，放在试管架上。,3、制备细菌悬液,4、涂布分离,涂布法分离细菌：在无菌条件下，分别取0.1 mL
5、的稀释度为10-3 、10-4和10-5的土壤稀释液（细菌悬液） ，分别加到装有全营养LB培养基和尿素培养基的培养皿（空白平板）中；再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释液（细菌悬液）均匀涂布到整个平面上。,接种,取0.1ml菌悬液,涂布分离,按浓度捆成一摞,5、 37恒温培养箱 倒置培养,四,1、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基,因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的
6、细菌的筛选，故用纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂,思考题：,2、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用,如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下就会被水解，水解后的NH3会使土壤变成碱性，NH3与其他阴离子物质如SO42、CO32、NO3等形成化合物，则会使土壤板结。 有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。,3、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现。,细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。,4、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落,因为全营养培养基中的氮源是蛋白胨，很多细菌都能利用它，而尿素培养基中的氮源只有尿素，只有含脲酶的细菌才能利用尿素，能存活。 这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有 极少数量。,
